王向濤，孫桂超，徐昶儒，韓 磊，劉日嘉，張 鑫，袁洪亮，肖 爽，蘇怡君

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076)

研究表明多糖類成分具有較好的免疫促進(jìn)作用，其在抗腫瘤、抗病毒、抗感染等方面表現(xiàn)出了較好的療效[1].多糖不僅具有抗腫瘤藥理作用，而且還可以降低化療藥物的不良反應(yīng)，在臨床上成為良好的化療輔助用藥，對化療療效的提高及降低不良反應(yīng)具有較大的幫助[2-5].

龍葵(Solanum nigrum L.)為茄科一年至多年生草本植物, 全草均可入藥[6]，具有抗腫瘤、抑菌、抗病毒作用，同時(shí)對神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等方面具有較好的作用，得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[7-10].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道龍葵中的生物堿類成分可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡等作用，而關(guān)于龍葵多糖是否對腫瘤具有一定的治療作用，尚未見報(bào)道，因此本文主要初步觀察了龍葵多糖對腫瘤的治療作用.

本文主要觀察了龍葵多糖(LP)的體內(nèi)外抗腫瘤作用，并觀察了其對免疫系統(tǒng)的初步影響.通過本研究為龍葵多糖的抗腫瘤作用的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

龍葵粗多糖：哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所提供；黃芪多糖(APS)：黑龍江省生物制藥一廠提供(批號：201301)；5-Fu：上海旭東海普藥業(yè)有限公司(批號：201211)；阿霉素：浙江海正藥業(yè)股份有限公司(批號：201304).

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株

昆明種小鼠，體重(20±2.0)g，雌雄各半，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供；瘤株：S180(肉瘤)、H22(肝癌)購自哈醫(yī)大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所；HepG-2和SGC-7901細(xì)胞由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所凍存復(fù)蘇.

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI-1640購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；疊氮鈉(NaN3)、MTT(噻唑藍(lán))、DMSO(二甲基亞砜)、胰蛋白酶購自Sigma公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉等試劑均為分析純.

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠(LD4-2A型)；

超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備廠；

電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠；

二氧化碳培養(yǎng)箱 美國NBS公司(CO-150型)；

倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；

酶標(biāo)儀 美國伯樂公司(680型)；

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

小鼠隨機(jī)分成6組：1)陰性對照組，2)陽性對照組(黃芪多糖組)，3)陽性對照組(5-Fu組)，4)龍葵多糖高劑量組，5)龍葵多糖中劑量組，6)龍葵多糖低劑量組.

2.2 MTT比色法測定龍葵多糖體外對HepG-2和SGC-7901兩種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

取對數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板(100μL/孔)，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后，分別加入5個(gè)濃度的龍葵多糖及5個(gè)濃度的陽性藥5-Fu，于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.72 h后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL的MTT 150 μL，于二氧化碳培養(yǎng)箱中作用4 h.4 h后，棄去MTT，各孔分別加入150 μL DMSO，搖勻，于570 nm波長下測定光密度(OD).根據(jù)測定的吸光度值計(jì)算抑制率并計(jì)算IC50.

抑制率(%)=(對照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值)×100%

2.3 龍葵多糖對S180實(shí)體瘤的抑制作用

生長良好的S180荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，腹部皮膚消毒后，用注射器無菌條件下小鼠腹腔抽取S180腹水，放入無菌容器內(nèi)，腹水應(yīng)為乳白色，如有紅色的溶血不可用.另取一滴腹水細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制片，瑞氏染色，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，其中癌細(xì)胞數(shù)為97%以上方可使用.按生理鹽水：腹水為4∶1的溶液稀釋，選用昆明種小鼠，體重(20±2 g)，雌雄各半，于小鼠右肢腋下接種，0.2 mL/只.

將接種后的小鼠60只，隨機(jī)分為6組，分別為LP高、中、低劑量組，陽性對照組(黃芪多糖對照組、5-Fu對照組)及陰性對照組.接種24 h后LP組分別以125、62.5、31.25 mg/kg三個(gè)劑量給藥，黃芪多糖對照組給藥劑量為100 mg/kg，5-Fu對照組給藥劑量為25 mg/kg，陰性對照組給相同體積的生理鹽水.腹腔給藥，每日1次，連續(xù)7 d.停藥次日處死，稱體重，取出瘤塊稱重，按如下公式計(jì)算抑制率，并觀察藥效與劑量間的關(guān)系.本實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次.

瘤重抑制率=

2.4 龍葵多糖對小鼠移植腫瘤H22的生命延長作用

實(shí)驗(yàn)步驟基本同2.3，區(qū)別在于造模時(shí)采用腹腔注射，而不是腋下注射.生命延長率計(jì)算公式如下：

生命延長率=

2.5 龍葵多糖對S180實(shí)體瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

荷瘤小鼠造模方法同2.3，將造模后的小鼠隨機(jī)分為6組，分別為LP高、中、低劑量組，陽性對照組(黃芪多糖對照組、5-Fu對照組)及陰性對照組.接種24 h后LP以125 mg/kg、62.5 mg/kg、31.25 mg/kg三個(gè)劑量給藥，黃芪對照組劑量100 mg/kg，5-Fu對照組劑量25 mg/kg，陰性對照組給相同體積的生理鹽水.腹腔給藥，每日給藥1次，連續(xù)給藥7d.停藥次日處死，稱體重，取脾、胸腺，用電子天平稱質(zhì)量，按下列公式計(jì)算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù).本實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次.

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.6 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以x±S表示，組間采用t-test進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MTT比色法測定龍葵多糖的體外對HepG-2和SGC-7901兩種腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用

結(jié)果如表1所示，龍葵多糖對HepG-2和SGC-7901均有一定的抑制作用，但抑制作用較弱.

表1龍葵多糖對HepG-2和SGC-7901腫瘤細(xì)胞半數(shù)抑制濃度

化合物IC50/(μg·mL-1)HepG-2SGC-7901LP189.60186.56CAM1.0319.19

3.2 龍葵多糖對S180小鼠瘤重的影響

如表2所示，龍葵多糖各劑量組S180小鼠平均瘤重均明顯低于生理鹽水組(P<0.01)，中劑量組抑制率可達(dá)40.13%，但高劑量抑瘤率不及中劑量組.

表2龍葵多糖對S180小鼠瘤重的影響

組別劑量/ (mg·kg-1)n質(zhì)量/g開始結(jié)束開始結(jié)束瘤重/g抑制率/%Control—121019.54±1.0723.16±1.962.10±0.40 —5-Fu25121120.30±0.9320.47±2.080.90±0.25??57.07APS100121019.13±0.8523.46±1.681.43±0.28??32.21LP125121219.87±0.7126.32±2.401.45±0.31??31.3462.5121219.85±0.5425.43±1.911.26±0.26??40.1331.25121019.31±0.3524.58±2.201.51±0.21??28.20

*P<0.05，**P<0.01 vs control

3.3 龍葵多糖對H22小鼠生存時(shí)間的影響

如表3所示，龍葵多糖各劑量組均能明顯延長H22小鼠生存時(shí)間(P<0.05，P<0.01)，其中劑量組生命延長率可達(dá)88.87%，明顯優(yōu)于APS對照組(P<0.05)，但高劑量組作用不及中劑量組.

3.4 龍葵多糖對S180小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響

如表4所示，龍葵多糖各劑量組均可顯著提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)(P<0.05或P<0.01).

表3龍葵多糖對H22荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響

組別劑量/(mg·kg-1)n開始結(jié)束平均生存天數(shù)/d生命延長率/%空白—121011.18±2.04—5-Fu25121224.10±3.57??107.53APS100121016.00±2.20??43.09LP125121221.10±3.78??78.7662.5121221.45±3.47??88.8731.25121115.20±2.70??42.89

*P<0.05，**P<0.01 vs control

表4龍葵多糖對S180荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)作用

組別劑量/ (mg·kg-1)n開始結(jié)束 結(jié)束時(shí)體重/g胸腺指數(shù)/(mg·g-1)脾指數(shù)/(mg·g-1)Control—121023.16±1.962.15±0.823.98±0.655-Fu25121120.47±2.081.82±0.623.25±1.13APS100121023.46±1.683.00±0.72?5.86±0.87??LP125121226.32±2.404.28±0.90?6.72±1.37??62.5121225.43±1.913.83±0.74??6.05±0.81??31.25121024.58±2.202.98±0.70?5.84±1.04?

*P<0.05，**P<0.01 vs control

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)對龍葵多糖成分體內(nèi)外抗腫瘤藥效進(jìn)行了研究.體外實(shí)驗(yàn)采用MTT法觀察了龍葵多糖對HepG-2和SGC-7901兩種人體腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用.結(jié)果顯示龍葵多糖對兩種腫瘤細(xì)胞的IC50分別為189.60 μg/mL和186.56 μg/mL，明顯高于中藥提取物細(xì)胞毒作用的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(10 μg/mL)，說明龍葵多糖對HepG-2和SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞毒性較弱.

抑瘤率和生命延長率是評估藥物在藥效學(xué)研究方面的基礎(chǔ)性指標(biāo)，減緩腫瘤的生長速度,甚至使瘤體縮小，是抗腫瘤藥物是否有效的重要指標(biāo)，生命延長率是驗(yàn)證藥物是否有效的藥效學(xué)整體評估指標(biāo).體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要觀察了龍葵多糖對S180實(shí)體瘤的抑制作用(以抑瘤率為指標(biāo))以及對H22腹水癌小鼠生存時(shí)間的延長作用(以生命延長率為指標(biāo)).結(jié)果表明龍葵多糖表現(xiàn)出良好的抑瘤效果和生命延長效果.其中龍葵多糖中劑量對S180小鼠的抑瘤率最大，達(dá)到了40.13%.并且在H22小鼠生存時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)高劑量組的荷瘤小鼠生存時(shí)間反而下降，就抑瘤率以及生存時(shí)間而言高劑量組小鼠的藥物效果低于其他劑量組，可能是因?yàn)槎嗵穷惓煞直容^粘稠，高濃度龍葵多糖體內(nèi)吸收不如其他劑量組造成的.

脾臟和胸腺是人體重要的免疫器官，其中脾臟是免疫細(xì)胞定居的場所，也是免疫應(yīng)答的場所；胸腺是T細(xì)胞發(fā)育的主要場所.機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)的同時(shí)，其質(zhì)量會(huì)增加，因此脾指數(shù)和胸腺指數(shù)可作為評估藥物對免疫器官的抑制作用的基礎(chǔ)指標(biāo)[11].研究發(fā)現(xiàn)，LP對荷瘤小鼠免疫器官具有保護(hù)作用，與陰性對照組比較胸腺指數(shù)和脾指數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度的增加，中高劑量組作用顯著(P<0.05或P<0.01).

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)有著密切的關(guān)系，機(jī)體免疫機(jī)能的降低有利于腫瘤的形成和發(fā)展，而癌癥患者常有免疫機(jī)能低下及免疫器官萎縮[12].特別是化療藥物的應(yīng)用，常引起機(jī)體免疫機(jī)能嚴(yán)重下降.而相關(guān)報(bào)道顯示，多糖類成分的抗腫瘤藥物均具有提高免疫能力和保護(hù)脾臟的作用[13-18].本研究結(jié)果提示，龍葵多糖抗腫瘤作用并非直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而可能是通過其強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)的.龍葵多糖類成分對腫瘤病人生命延長和提高免疫力方面有很好的應(yīng)用前景.

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄭 敏, 王亞平. 中藥多糖抗腫瘤的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué): 中醫(yī)中藥分冊, 2000, 22(5): 259-263.

[2] 李 汾, 彌 曼, 袁秉祥. 中藥多糖的非免疫抗腫瘤作用機(jī)制[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2006, 14(6): 748-750.

[3] 林 俊, 李 萍, 陳靠山. 近5年多糖抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志, 2013, 08: 1116-1125.

[4] 毛 健, 馬海樂. 靈芝多糖的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2010, 01 :295-299.

[5] 申利紅, 王建森, 李 雅, 等. 植物多糖的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 02: 349-352.

[6] 趙國平, 戴 慎, 陳仁壽, 等. 中藥大辭典[M].上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2006.873.

[7] ZAIDI S K, HODA M N, TABREZ S,etal. Protective effect of Solanum nigrum leaves extract on immobilization stress induced changes in rat's brain [J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014: 912450-912456.

[8] 胡 兵, 安紅梅, 沈克平, 等. 龍葵對人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞粘附、移動(dòng)和侵襲的影響[J]. 中藥材, 2013, 36(6): 958-961.

[9] CHEN H, QI X. Study on the effect of polysaccharides from Solanum nigrum Linne on cellular immune function in tumour-bearing mice [J]. African Journal Traditional, Complementary Alternative Medicines, 2013, 10(4): 41-46.

[10] 李秀霞. 龍葵的藥理作用及臨床應(yīng)用[J]. 佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1998, 21(1): 23-25.

[11] 梁秀宇. 消風(fēng)散對變應(yīng)性接觸性皮炎的抑制作用及其免疫學(xué)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D] . 沈陽: 遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 2007.

[12] 王麗君, 劉 良, 王正鐸, 等. 北方野生龍葵濃縮果汁營養(yǎng)成份的測定[J]. 特產(chǎn)研究, 1999(4): 21-22, 41.

[13] 那順孟和, 楊秋林, 米 拉, 等. 野生龍葵果中礦物質(zhì)及維生素含量的分析研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 21(3): 35-38.

[14] 米 拉, 楊秋林, 那順孟和,等. 野生龍葵過中營養(yǎng)成分的研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002, 3(1): 98-100.

[15] 劉 穎, 張燕玲, 王 雁. 從天然植物龍葵中提取生物堿的工藝研究[J]. 遼寧絲綢, 2003(2): 32-45.

[16] 趙曉琴, 曾祥法. 龍葵片對原發(fā)性肝癌治療作用的臨床研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2002, 11(29): 671-672.

[17] 潘偉光, 劉宗潮, 潘啟超, 等.中藥復(fù)方龍葵合劑在動(dòng)物體內(nèi)外的抗癌藥效[J].癌癥, 1996, 15(6): 438-440.

[18] 孫海波，高世勇，季宇彬.龍葵糖蛋白對MCF-7細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，27(6)：772-775，784.