李胤靜，張娜，楊寶柱，劉雪梅，陳迪

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱150076)

大豆蛋白除了具有極高的營養(yǎng)價值外，還具有持水、乳化、吸油、凝膠、起泡、粘結等功能特性。由于其良好的功能特性、較高的營養(yǎng)價值和低廉的價格，使其被廣泛應用于多種食品體系[1]。而大豆分離蛋白又是其中的代表性物質，所以有很多人用不同的研究方法對大豆分離蛋白進行處理[2-5]，進而改善其功能性質，使其更廣泛的應用于各個領域[6-10]。各種改性方法中酶修飾綜合了其他反應的優(yōu)點，被大家廣泛認可，并進行各項研究，但現(xiàn)有的研究一般采用的是單一酶對大豆分離蛋白進行處理[11-12],可在此類研究的基礎上進一步利用雙酶更好的改善大豆分離蛋白的功能性。

本研究利用Alcalase堿性蛋白酶(內(nèi)切酶)對大豆分離蛋白進行限制性酶解。通過對酶解過程的優(yōu)化，利用電泳對酶解產(chǎn)品進行表征，并考察了酶解前后大豆分離蛋白的功能性，確定雙酶酶解對大豆分離蛋白功能性質的改善程度，為大豆分離蛋白產(chǎn)品更好的應用提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

材料：大豆分離蛋白(SPI，蛋白質含量90.1%，干質量)。Alcalase堿性蛋白酶(酶活2000U/g)，其他試劑為分析純，所用的水為去離子水。

主要儀器設備：全自動凱氏定氮儀(瑞士 Foss 公司)；真空冷凍干燥機(上海醫(yī)用分析儀器廠)；高速離心機(上海安亭科技儀器廠)；電子分析天平(塞多利斯科學儀器有限公司)；精密 pH 計(上海雷磁儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；恒溫干燥箱(上海東星建材實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大豆分離蛋白的酶解

用去離子水配制底物濃度為10%的大豆分離蛋白分散液，以酶活2000 U/g，溫度60℃，pH為8.0，反應時間50min為基準條件，研究堿性蛋白酶各項單因素對水解度的影響，根據(jù)實驗結果選擇適當?shù)膶嶒灄l件制備酶解產(chǎn)物，經(jīng)冷凍干燥，制備酶解產(chǎn)物的干粉。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 蛋白質水解度的測定

大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物DH測定采用pH-stat 法[13]。

B：水解過程中消耗NaOH溶液的體積(mL)；

N：NaOH溶液的濃度(mol/L)；

α：大豆分離蛋白氨基的平均解離度；

M：底物蛋白質含量(g)；

h：蛋白質中總的可被水解的肽鍵數(shù)(大豆蛋白為 7.8 mmol/g)。

1.2.2.2 氨基氮含量的測定

大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物氨基氮含量的測定采用甲醛滴定法[14]。

V=樣品耗用氫氧化鈉標準溶液毫升數(shù)；

V0=空白耗用氫氧化鈉標準溶液毫升數(shù)；

N=氫氧化鈉標準溶液摩爾濃度。

1.2.2.3 大豆蛋白產(chǎn)品的溶解性評價

大豆分離蛋白的溶解性測定方法參考文獻進行[15]。

NSI (%) = 可溶性氮/總氮×100

1.2.2.4 大豆蛋白產(chǎn)品的保水性評價

大豆分離蛋白的保水性測定方法參考Surówka K(2004)[16]。

1.2.2.5 大豆蛋白產(chǎn)品的吸油性評價

大豆分離蛋白的吸油性測定方法參考Moure Andrés(2005)[17]。

1.2.2.6 大豆蛋白產(chǎn)品的乳化活性評價

大豆分離蛋白的乳化活性測定方法參考Moure Andrés，2005[17]。

EAI(m2/g)=2[T×A0×稀釋倍數(shù)/(C×Φ×L×10)]

T=2.303

A0=零時刻的吸光度值；

C=乳狀液形成前配制的蛋白質濃度(g/L)；

Φ=乳狀液油相的體積分數(shù)；

L=比色杯厚度(cm)。

1.2.2.7 SDS凝膠電泳

采用不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳。具體實驗方法參考郭堯君(1999)[18]。

2 結果與分析

2.1 大豆分離蛋白的限制性酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化

稱取大豆分離蛋白樣品30.00 g于錐形瓶中，加入蒸餾水270 mL，使其充分分散，配制成濃度10% (w/w)的大豆分離蛋白分散液，然后置于以酶活2000 U/g，溫度60℃，pH為8.0，反應時間50min為基準條件，控制其中三項不變，分別改變其中一項，研究Alcalase堿性蛋白酶中各項單因素對水解度的影響，結果見圖1。

由圖1a反映出大豆分離蛋白的DH在20～200min內(nèi)隨反應時間的增加而增大，但增加的趨勢減緩，所以選擇時間時，綜合時間利用率考慮可知不是時間越長越合適；在酶活500～2500 U/g內(nèi)DH隨著酶活的增加而增大，但增加趨勢較為緩慢(圖1b)，說明在此范圍內(nèi)受酶活影響相對其他因素影響較小，故綜合酶的使用率考慮不是酶活越大越合適；在pH值7.0～9.0范圍內(nèi)，DH隨著pH值的增加而先增加后降低(圖1c)，在pH值為8.0左右達到最適值，說明Alcalase蛋白酶反應時pH值可選擇在8.0左右；溫度在50～70℃范圍內(nèi)，DH隨著溫度的增加而先增加后降低(圖1d)，在溫度為60℃左右達到最適值，說明Alcalase堿性蛋白酶反應時溫度可選擇在60℃左右。

所以，綜合成本，時間利用率等各項因素考慮，本研究選擇酶活2000 U/g，溫度60℃，pH為8.0的條件下，酶解1h的工藝參數(shù)，在該工藝參數(shù)下酶解大豆分離蛋白得到DH為4.97%的酶解產(chǎn)物。

(a)

(b)

(c)

(d)

2.2 大豆分離蛋白的酶解電泳分析

對經(jīng)過限制性酶解的SPI產(chǎn)物與未酶解的SPI的進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖如圖2所示。

圖2 SPI與酶修飾SPI的凝膠電泳圖

大豆蛋白的主要組分是7S和11S球蛋白。7S組分主要含有3個亞基，分別是α、α’和β亞基；11S組分(A和B)是由酸性亞基和堿性亞基組成的六聚體，酸性亞基和堿性亞基間通過一個二硫鍵相連。從電泳分析結果可以看出：在Alcalase蛋白酶作用下，大豆蛋白的α亞基、α’ 亞基和β亞基均發(fā)生水解。11S不同水解片段集中31.0 kD和20.1 kD之間。

2.3 大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物功能性質評價

(a)

(b)

(c)

(d)

由圖3(a)顯示，SPI與酶修飾SPI的等電點都在 pH 4.5 附近，酶解處理明顯提高了SPI的溶解性。未經(jīng)過酶解的SPC在等電點的NSI為2.91%，經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶限制性酶解后，在等電點的NSI為49.50%。Alcalase堿性蛋白酶的催化作用位點較多，導致堿性蛋白酶修飾產(chǎn)品中短分子片段多，因此溶解性很大程度的提高。

由圖3(b)顯示，經(jīng)過酶解修飾處理，明顯地降低了酶解修飾分離蛋白的保水性。大豆分離蛋白的保水率為5.07g/g，而Alcalase堿性蛋白酶酶解保水率為1.89g/g?？赡苁怯捎陔S著DH的增加而形成很多的小分子，不利于形成蛋白質的網(wǎng)狀結構(凝膠)，導致保水性降低。

由圖3(c)顯示，SPI的吸油率最高，酶修飾后的SPI產(chǎn)物的吸油率都有不同程度的降低。SPI的吸油率為0.99g/g，經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶酶解后，吸油率為0.72g/g。蛋白質的溶解性取決于蛋白質分子的親水性/疏水性的平衡，這種平衡取決于蛋白質分子的氨基酸組成，尤其取決于暴露于蛋白質分子表面的氨基酸組成[19]。Alcalase堿性蛋白酶水解作用的主要位點是 Tyr、Phe、Try 等芳香族疏水性氨基酸殘基的肽鍵和Ala-，Leu，Val，所以隨著水解的進行，疏水基團和親水基團的數(shù)量發(fā)生改變，因此吸油率降低。

由圖3(d)顯示，SPI的酶解處理提高了酶解產(chǎn)品的乳化活性指數(shù)。SPI的乳化活性指數(shù)為35.97m2/g，經(jīng)過Alcalase堿性蛋白酶處理，乳化活性指數(shù)為40.55m2/g。酶解使蛋白質分子變小、構象發(fā)生改變，一些包埋于蛋白質內(nèi)部的疏水性殘基暴露，利于其向水油界面擴散降低界面張力，同時，水解后的肽分子更易定位于水油界面，排列更為有序[20]。所以，酶解產(chǎn)品的乳化活性指數(shù)較SPI有一定的提高，但是較大水解度的產(chǎn)物中低分子質量的肽分子過多，所以會降低乳化活性指數(shù)的提高程度。

3 結論

利用Alcalase堿性蛋白酶對SPI在酶活2000U/g，溫度60℃，pH為8.0的條件下，酶解1h，可制得水解度為4.97%的酶解產(chǎn)物。電泳分析結果表明：在雙酶酶解下，α亞基、α’ 亞基和β亞基被水解，11S不同水解片段集中31.0 kD和20.1 kD之間。SPI經(jīng)過酶解修飾后，其溶解性有很大程度的提高，在等電點 pH 4.5處，溶解性從2.91%增大至49.50%；而保水性則降低，保水率從5.07g/g降低到了1.89g/g；吸油率從0.99g/g變化為0.72g/g；乳化活性指數(shù)從35.97m2/g變化為40.55 m2/g，有一定程度的提高。結果表明，經(jīng)過Alcalase堿性蛋白酶限制性酶解后，大豆分離蛋白的功能性質均有不同程度的改善。

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