賈云鶴

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱150069)

西瓜細(xì)菌性果實(shí)腐斑病，又稱西瓜果斑病、果腐病(Bacterial Fruit Blotch，簡(jiǎn)稱BFB)，是種傳細(xì)菌性病害。該病害的病原菌為燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliWillems et al)。該病害近年來(lái)由國(guó)外傳入中國(guó)，該病害發(fā)病、傳播迅速，危害嚴(yán)重。目前國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有免疫品種，也缺乏特效的防治藥劑[1]。

近年來(lái)，黑龍江省西瓜主產(chǎn)區(qū)果斑病爆發(fā)嚴(yán)重。西瓜主產(chǎn)區(qū)雙城2009年、2010年的果斑病發(fā)病率達(dá)到70％以上，給瓜農(nóng)造成了巨大的損失。針對(duì)這些情況，本試驗(yàn)對(duì)黑龍江地區(qū)露地西瓜的果斑病病原菌進(jìn)行分離、純化、鑒定，以期在下一步試驗(yàn)中根據(jù)黑龍江省西瓜果斑病病原菌的特性，找出適合防治黑龍江省西瓜果斑病的有效方法。

1 材料與方法

從黑龍江省露地西瓜主產(chǎn)區(qū)哈爾濱、雙城、齊齊哈爾、牡丹江、佳木斯、大慶等地進(jìn)行病樣采集。取樣部位為病瓜內(nèi)表皮(西瓜皮白色的部分)。病原菌的分離、純化方法為平板劃線法。病原菌鑒定方法包括病原菌的致病性測(cè)定、病原菌的培養(yǎng)性狀觀察、顯微形態(tài)觀察及染色、PHB積累(類脂粒顆粒)、金氏B培養(yǎng)基(KBA)上熒光色素的產(chǎn)生、病原菌的生理生化測(cè)定(甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn))、寄主范圍測(cè)定。試驗(yàn)方法參照方中達(dá)的《植病研究法》[2]和任欣正的《植物病原細(xì)菌的分類和鑒定》[3]。

病原菌對(duì)西瓜的致病性測(cè)定：將獲得的純培養(yǎng)菌株在30℃培養(yǎng)24～48h，制成108cfu/mL菌懸液，采用噴霧法將病原菌接種到健康無(wú)病西瓜苗上，28℃下保濕24～48h，記錄出現(xiàn)病癥的時(shí)間。接種10天之后無(wú)病癥視為無(wú)致病性。

病原菌的培養(yǎng)性狀觀察、顯微形態(tài)觀察及染色：觀察菌體形態(tài)、測(cè)定菌體大小。電鏡觀察菌體的顯微形態(tài)。對(duì)有致病性的菌株，按一般細(xì)菌學(xué)常規(guī)方法，30℃下培養(yǎng)24～48h后進(jìn)行革蘭氏染色；

PHB積累(類脂粒顆粒)：按常規(guī)方法制成涂片后，用蘇丹黑(蘇丹黑B 0.3g；70％乙醇100mL)染10min，用水沖去染劑，再用二甲苯?jīng)_洗至涂片無(wú)色，然后用0.5％番紅水溶液復(fù)染1～2min，水洗，吸干后鏡檢。

金氏B培養(yǎng)基(KBA)上熒光色素的產(chǎn)生：將病原菌接在KBA培養(yǎng)基上,24～48h后在波長(zhǎng)254nm的紫外燈下檢查熒光色素的產(chǎn)生。

病原菌的生理生化測(cè)定：甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)分別采用葡萄糖蛋白胨營(yíng)養(yǎng)液試管、蛋白胨水培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。

寄主范圍測(cè)定：將30℃培養(yǎng)36h的菌株配成108cfu/mL的菌懸液采用噴霧法分別接種于健康的下列作物上：西瓜(Citrulli)、甜瓜(Cucumismelo)、黃瓜(Cucumissativus)、南瓜(Cucurbitamoschata)、西葫蘆(Cucurbitapepo)、茄子(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicumfrutescens)、番茄(Lycopersiconesculentum)，共8種作物。接種后28℃下用塑料薄膜保濕48h，一周后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

從黑龍江省各市縣18點(diǎn)采樣，分離出病原菌18份，病原菌的理化特性詳見(jiàn)表1。其中8份在接種試驗(yàn)中對(duì)西瓜具有致病性，分別為采樣自哈爾濱市黑龍江省園藝分院的H-hrb-1、采樣自哈爾濱市黑龍江省紅旗農(nóng)場(chǎng)的H-hrb-2、采樣自雙城市周家鎮(zhèn)的H-sc-1、采樣自雙城市三鄰村的H-sc-2、采樣自齊齊哈爾市富拉爾基區(qū)的H-qqhr-1、采樣自牡丹江市寧安縣的H-mdj-2、采樣自佳木斯市集賢縣的H-jms-1、采樣自大慶杜蒙縣的H-dq-1。

根據(jù)這8個(gè)菌株革蘭氏染色反應(yīng)陰性；顯微形態(tài)為菌體桿狀，大小為(2～3)μm×0.5μm，單極生鞭毛；培養(yǎng)性狀為菌落突起，乳白色，大小為1～2mm；由此可以確定這8個(gè)菌株為食酸菌屬(Acidovorax)。

根據(jù)這8個(gè)菌株能積累PHB，在KBA培養(yǎng)基上不產(chǎn)生熒光色素，可以確定兩個(gè)菌株為燕麥?zhǔn)乘峋?Acidovoraxavenae)。

根據(jù)這8個(gè)菌株甲基紅和V-P反應(yīng)陰性，不能產(chǎn)生吲哚，能寄生在西瓜上，可以確定這8個(gè)菌株為燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliWillems et al)。

這8個(gè)菌株的寄主范圍不盡相同，H-sc-1只在西瓜上發(fā)病，H-hrb-2只在西瓜和茄果類作物上發(fā)病。

表1 不同地點(diǎn)病原菌的理化特性

3 結(jié)論與討論

3.1 通過(guò)8個(gè)對(duì)西瓜具有致病性菌株的生理生化測(cè)定，可以確定黑龍江省西瓜主產(chǎn)區(qū)的露地西瓜細(xì)菌性果斑病病原菌為燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliWillems et al)。

3.2 通過(guò)對(duì)這8個(gè)菌株寄主范圍的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)黑龍江省西瓜細(xì)菌性果斑病病原菌應(yīng)該分兩個(gè)類型：H-sc-1只和H-hrb-2為一個(gè)類型，只侵染西瓜；其他菌株為一個(gè)類型，侵染包括西甜瓜在內(nèi)多種葫蘆科作物和茄果類作物。這個(gè)結(jié)果和前人的研究相似：Walcott等人研究了Aac的分化現(xiàn)象[4]。他將世界各地56個(gè)菌株的DNA酶切處理后獲得的指紋圖譜進(jìn)行了PFGE(脈沖電場(chǎng)凝膠電泳)，認(rèn)為這些菌株的遺傳表形已經(jīng)有了分化，可以分為24個(gè)單元型。這些單元型有可分為2組：1組中菌株的寄主包括多種瓜類作物，2組中菌株的寄主全部來(lái)自西瓜。

[1]Francisco C. Q. Carvalho,et al.Selection of watermelon genotypes for resistance to bacterial fruit blotch[J]. Euphytica 2013,2(190)：169-180.

[2]方中達(dá).植病研究法[M]. 3版.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1997：156-211.

[3]任欣正.植物病原細(xì)菌的分類和鑒定[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1992：29-39.

[4]Walcott R. R.,et al. Role of blossoms in watermelon seed infestation by Acidovorax avenae subsp. Citrulli[J]. Phytopathology,2003,93:528-534.