朱書宇，黃程新，胡啟平Δ?，黃秒，舒?zhèn)?，方?/p>

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，廣西南寧530021；2.中國人民解放軍第三○三醫(yī)院，廣西南寧530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧530021）

蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin基因的克隆及原核表達

朱書宇1，黃程新2，胡啟平1Δ?，黃秒3Δ?，舒?zhèn)?，方玲1

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，廣西南寧530021；2.中國人民解放軍第三○三醫(yī)院，廣西南寧530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧530021）

目的構(gòu)建蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的原核表達載體，并誘導(dǎo)其表達重組Agkihpin，為將來量產(chǎn)Agkihpin提供方法和依據(jù)。方法RT-PCR法擴增Agkihpin基因，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET30a（＋）-Agkihpin和pEASY-E1-His6-Agkihpin，并轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳觀察重組蛋白Agkihpin的表達情況，Western blot檢測其特異性。結(jié)果成功構(gòu)建Agkihpin的原核表達載體pEASY-E1-His6-Agkihpin和pET30a（＋）-His6-Agkihpin，并利用pEASY-E1-His6-Agkihpin首次在大腸桿菌BL21（DE3）中表達出分子量約為30kD的His6-Agkihpin重組融合蛋白。結(jié)論首次實現(xiàn)了His6-Agkihpin重組融合蛋白在原核系統(tǒng)中的高效表達，為Agkihpin將來量產(chǎn)提供了方法和實驗依據(jù)。

蛇毒精氨酸酯酶；類凝血酶；Agkihpin；原核表達；克隆

蛇毒精氨酸酯酶（arginine esterase，AEase）是一類絲氨酸蛋白酶，部分具有類凝血酶（thrombin-like enzymes）活性，能直接作用于纖維蛋白原釋放血纖肽FPA和FPB，導(dǎo)致纖維蛋白單體首尾聚合而凝固，所以這類酶又常被稱為類凝血酶［1］。蛇毒蛋白在藥物方面的研究主要集中在抗凝血、止血、溶血栓［2］、鎮(zhèn)痛［3］和抗癌［4］等方面。目前已有數(shù)十種用于臨床治療和診斷，如蝮蛇抗栓酶（Ahylysantinfarctase）用于治療腦血栓、大動脈炎、靜脈系統(tǒng)血栓等癥；降纖酶（defibrase）用于治療急性腦梗、非特異性心絞痛；蛇毒血凝酶（hemocoagulase）用于大出血的預(yù)防和治療等等［4-6］。蛇毒蛋白抗癌研究主要集中在抗腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移［7-9］、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抗腫瘤血管生成、抑制腫瘤細胞生長和增值等方面［10-12］。Agkihpin是從江浙蝮蛇（短尾蝮）蛇毒中分離得到的一種分子量約為25.46KDa、等電點約為7.43，含235個氨基酸殘基的電泳純AEase［13］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)Agkihpin對人鼻咽癌細胞的活力、遷移、增殖有明顯的抑制作用，且劑量依賴效應(yīng)顯著［14］；Agkihpin可能通過下調(diào)MRP1、COX-2的表達來抑制鼻咽癌和肝癌細胞的活力及癌細胞的增殖，上調(diào)E-CD的表達來抑制肝癌細胞的遷移［15-19］。上述研究表明Agkihpin對肝癌和鼻咽癌防治具有潛在的藥用價值，但是天然蛇毒中Agkihpin含量比較低，而且分離提純成本高、難度大。鑒于蛋白質(zhì)分子克隆存在經(jīng)濟快速等優(yōu)點，本研究擬利用蛋白質(zhì)分子克隆技術(shù)來可持續(xù)地開發(fā)利用蛇毒資源，并用于高發(fā)性惡性腫瘤如肝癌、鼻咽癌的防治。

本實驗擬利用2種表達質(zhì)粒，通過基因克隆方法獲取重組Agkihpin，為今后的深入研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑 分離純化的Agkihpin蛋白、pET 30a（＋）載體和E.coliDH5α菌株均由廣西醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室提供；pUCm-T載體、PCR引物均購于上海生物工程有限公司；總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購于北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于加拿大Fermentas生物技術(shù)有限公司；pEASY-E1 Expression Kit、BL21（DE3）菌株均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR相關(guān)試劑購于大連TaKaRa寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶均購于New England Biolabs；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的Agkihpin基因序列（KC537786.1和KC537787.1），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，F(xiàn)orward Primer：5'-CCGGAATTCATGAT CTTGGGAGATGATGAAT-3'，Reverse Primer：5'-CCGCTCGAGTAACATTTTCAACAGTTT TCACGGG-3'，劃線部分分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，CCG為保護堿基，引物經(jīng)BLAST比對后由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR獲取目的片段與克隆T載體的構(gòu)建：總RNA試劑盒法提取毒腺組織總RNA，F(xiàn)ermentas MBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以該鏈為模板擴增Agkihpin目的基因片段，構(gòu)建pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，藍白斑篩選出陽性克隆子，對其進行菌落PCR鑒定，并送上海生物工程公司測序，將測序正確的陽性克隆子命名為pUCm-T-His6-Agkihpin保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組表達質(zhì)粒pET30a（＋）-His6-Agkihpin的構(gòu)建、鑒定與誘導(dǎo)表達：帶粘性末端的Agkihpin基因片段與pET30a（＋）質(zhì)粒的連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，藍白斑篩選出陽性克隆子，對其進行菌落PCR及XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定，并送上海生物工程公司測序。將測序正確的陽性重組表達質(zhì)粒pET30a（＋）-His6-Agkihpin轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，LB／X-gal平板篩選陽性菌落，再接種到LB／Amp液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r／min，OD600約0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度分別為0.1、0.5、1 mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，SDS-PAGE和重組Agkihpin蛋白表達情況。

1.2.4 重組表達質(zhì)粒pEASY-E1-His6-Agkihpin的構(gòu)建、鑒定與誘導(dǎo)表達：重新設(shè)計引物，去掉原引物中的保護堿基和酶切位點，以重組表達質(zhì)粒pET30a（＋）-His6-Agkihpin為模板PCR擴增目的片段后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pEASY-E1-His6-Agkihpin，用T7 promoter primer和Agkihpin基因的反向引物鑒定重組子，并取1mL菌液送到上海生物工程有限公司測序鑒定。測序正確的重組表達質(zhì)粒pEASY-E1-His6-Agkihpin轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，LB／X-gal平板篩選陽性菌落，接種到LB／Amp液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r／min，OD600約0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為分別為0.1、0.5、1 mmol／L，繼續(xù)培5 h，SDS-PAGE觀察重組Agkihpin蛋白表達情況。

1.2.5 Western blot觀察重組Agkihpin蛋白表達情況：將1.2.3和1.2.4中的SDS-PAGE電泳蛋白膠用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件是恒壓25 v，1 h。之后用5%BSA室溫封閉1.5 h，加入濃度比為1∶1000抗多聚組氨酸6×His的小鼠單克隆抗體，室溫搖床孵育3 h，TBST緩沖液洗膜3次，5min／次，再用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗室溫搖床孵育1.5 h，TBST洗3次，5 min／次，最后用ECL試劑盒顯色后，在暗室內(nèi)曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 Agkihpin基因的克隆 質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在約750bp（含引物上的保護堿基與酶切位點）處有一條背景清晰、干凈明顯的條帶（lane 1），與GenBank公布的KC537786.1和KC537787.1理論值相符，可見通過RT-PCR從江浙蝮蛇毒腺總RNA中擴增出了Agkihpin的基因序列（見圖1）。

2.2 重組克隆質(zhì)粒pUCm-T-Agkihpin的鑒定 將構(gòu)建的pUCm-T-Agkihpin質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，藍白斑篩選，挑出10個陽性單菌落，培養(yǎng)后以菌液為模板、PCR擴增Agkihpin目的基因。質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，菌液PCR結(jié)果中有3個克隆的條帶位置與理論值750 bp相符，如圖2所示，表明pUCm-T-Agkihpin質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 pUCm-T-Agkihpin菌液PCR結(jié)果圖M：Trans 2KTM Plus IIDNA Marker；1-10：10個克隆菌液PCRFig.2 Broth PCR results of pUCm-T-AgkihpinLane M：Trans 2KTM Plus IIDNA Marker；Lane 1-10：10 T-A clonings of the bacilli PCR

2.3 pET30a（＋）-His6-Agkihpin的構(gòu)建、表達和鑒定pUCm-T-Agkihpin菌液PCR測序結(jié)果與GenBank序列KC537786.1和KC537787.1對比發(fā)現(xiàn)，10號重組克隆質(zhì)粒pUCm-T-Agkihpin有變異，所以用與KC537787.1一致的7號或9號構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET30a（＋）-His6-Agkihpin并轉(zhuǎn)染E.coli DH5α菌株。菌液PCR擴增Agkihpin基因序列結(jié)果表明，10個克隆擴增條帶與理論值750 bp相符（含引物上的酶切位點與保護堿基），表明成功構(gòu)建了Agkihpin 5'端第366位堿基為A的重組表達質(zhì)粒pET30a（＋）-His6-Agkihpin，見圖3。

圖3 pET30a（＋）-His6-Agkihpin菌液PCR結(jié)果圖M：Trans2KTM Plus IIDNA Marker；1-10：10個pET30a（＋）-His6-Agkihpin-7單克隆菌落PCRFig.3 Broth PCR results of pET30a（＋）-His6-AgkihpinLane M：Trans 2KTM Plus IIDNA Marker；Lane 1-10：10 monoclonalcolony PCR of pET30a（＋）-His6-Agkihpin-7

選擇陽性克隆菌，提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重組質(zhì)粒切下來的條帶與理論值750 bp相符，表明重組載體構(gòu)建成功，見圖4。

圖4 重組表達質(zhì)粒pET30a（＋）-His6-Agkihpin雙酶切鑒定圖M：DSTM 5000；1：pET30a（＋）質(zhì)粒雙酶切；2-3：pET30a（＋）-His6-Agkihpin雙酶切；4-5：pET30a（＋）-His6-Agkihpin菌液PCRFig.4 Double restriction enzyme digestion results of recombinant expression plasmid pET30a（＋）-His6-AgkihpinLane M：DSTM 5000；Lane 1：pET30a（＋）plasmid double digested；Lane 2-3：pET30a（＋）-His6-Agkihpin double digestion；Lane 4-5：pET30a（＋）-His6-Agkihpin broth PCR

重組表達質(zhì)粒pET30a（＋）-His6-Agkihpin轉(zhuǎn)染BL21（DE3）菌株，經(jīng)各種濃度IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測未發(fā)現(xiàn)重組蛋白條帶。

2.4 pEASY-E1-His6-Agkihpin的構(gòu)建、表達和鑒定 以pET30a（＋）-His6-Agkihpin為模板、用去掉保護堿基和酶切位點的引物擴增Agkihpin基因，并將擴增產(chǎn)物與pEASY-E1連接后轉(zhuǎn)染E.coli DH5α菌株。用T7 promoter primer和Agkihpin基因的反向引物鑒定重組子，5個克隆擴增出的條帶均約為750bp，與理論值相符；隨機選取3個克隆的PCR產(chǎn)物測序，發(fā)現(xiàn)均與KC537787.1完全一致，表明成功構(gòu)建了5'端第366位堿基為A的Agkihpin重組表達質(zhì)粒pEASY-E1-His6-Agkihpin，菌液PCR和測序結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 pEASY-E1-His6-Agkihpin菌液PCR結(jié)果圖M：Trans 2KTM Plus IIDNA Marker；1-10：10個pEASYE1-His6-Agkihpin單克隆菌落PCRFig.5 Broth PCR results of pEASY-E1-His6-AgkihpinLane M：Trans 2KTM Plus IIDNA Marker；Lane1-10：10 monoclonal colony PCR

圖6 pEASY-E1-His6-Agkihpin菌液PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與KC537787.1比較Fig.6 Comparison of the sequences of pEASY-E1-His6-Agkihpin broth PCR productwith KC537787.1

重組表達質(zhì)粒pEASY-E1-His6-Agkihpin經(jīng)轉(zhuǎn)染和IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)菌液經(jīng)超聲破碎、離心后，取上清、沉淀與誘導(dǎo)菌液及未誘導(dǎo)菌液進行SDS-PAGE檢測，膠上約30 kD處出現(xiàn)明顯的亮帶（見圖7），結(jié)果顯示His6-Agkihpin主要存在于包涵體中。用image plus 7.0軟件測量、計算重組融合蛋白His6-Agkihpin分子遷移率，并計算得其分子量為29.77kD，與ExPASy數(shù)據(jù)庫從測序結(jié)果推斷的蛋白分子量28.07 kD相近。

圖7 Result of pEASY-E1-His6-Agkihpin-9誘導(dǎo)表達Agkihpin結(jié)果圖M：PageRulerTM Prestained Protein Ladder；1：未誘導(dǎo)菌液；2：誘導(dǎo)5 h菌液；3：誘導(dǎo)菌液上清；4：誘導(dǎo)菌液沉淀Fig.7 pEASY-E1-His6-Agkihpin-9 induced expression AgkihpinLane M：PageRulerTM Prestained Protein Ladder；Lane 1：Uninduced bacteria；Lane 2：The bacteria induced 5 h；3：Supernatant of induced cell lysate；4：Precipitate of induced cell lysate

2.5 重組蛋白的Western blot分析 重組表達質(zhì)粒pET30a（＋）-His6-Agkihpin沒有誘導(dǎo)表達出重組蛋白，所以PVDF膜上也沒有出現(xiàn)目的條帶。而另一重組質(zhì)粒pEASY-E1-His6-Agkihpin-9則誘導(dǎo)表達了重組蛋白，PVDF膜上可以清晰的看到目的條帶（見圖8），結(jié)果顯示重組蛋白與His標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生了特異性的反應(yīng)，His6-Agkihpin在大腸桿菌中表達正確，且主要是以包涵體的形式存在。

圖8 pEASY-E1-His6-Agkihpin-9的Western blot結(jié)果圖1：未誘導(dǎo)菌液；2：誘導(dǎo)5h菌液；3：誘導(dǎo)菌液上清；4：誘導(dǎo)菌液沉淀Fig.8 Western blot of pEASY-E1-His6-Agkihpin-9Lane 1：Uninduced bacteria；Lane 2：The bacteria induced 5h Lane；3：Supernatant of induced cell lysate Lane；4：Precipitate of induced cell lysate

3 討論

大腸桿菌表達系統(tǒng)在外源基因的原核表達中應(yīng)用最廣泛且最成熟，作為基因工程宿主菌已經(jīng)應(yīng)用到多種重組蛋白質(zhì)的工業(yè)級大規(guī)模生產(chǎn)。跟其它表達系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)存在許多優(yōu)點，如表達系統(tǒng)的遺傳圖譜明確，對外源蛋白耐受力強，容易實現(xiàn)重組蛋白的高水平表達且費用相對較低，后期蛋白純化方便簡單等。本實驗選用了BL21（DE3）作為宿主菌，pET30a（＋）和pEASY-E1兩種質(zhì)粒作為載體，構(gòu)建pET30a（＋）-His6-Agkihpin和pEASY-E1-His6-Agkihpin 2種重組質(zhì)粒，主要是比較2種質(zhì)粒對His6-Agkihpin的表達能力，結(jié)果其中pEASY-E1-His6-Agkihpin重組質(zhì)粒首次實現(xiàn)成功表達His6-Agkihpin重組蛋白。

未能從pET30a（＋）-His6-Agkihpin重組質(zhì)粒中表達出His6-Agkihpin可能與His6-Agkihpin有磷脂酶A2（Phospholipase A2，PLA2）活性有關(guān)。PLA2是一類分布廣泛的酶家族，參與磷脂的代謝［20］。研究發(fā)現(xiàn)PLA2可以殺死大腸艾希氏菌、單細胞增多性李氏忒氏菌和金黃色葡萄球菌等，可能與機體防御細菌感染有關(guān)［21-23］。Agkihpin在結(jié)構(gòu)上與蛇毒PLA2非常相似，因此His6-Agkihpin可能也有PLA2活性，在誘導(dǎo)的過程中殺傷細菌，從而使之不能進一步表達His6-Agkihpin。

然而選用pEASY-E1質(zhì)粒作為載體，該載體能直接利用T7啟動子較準(zhǔn)確地調(diào)控、表達目的蛋白，因此構(gòu)建的pEASY-E1-His6-Agkihpin重組質(zhì)粒可以成功表達出重組蛋白。同時pEASYE1載體上偶聯(lián)連接酶，使連接過程更加快捷簡單；研究中所用的誘導(dǎo)條件為37℃，180 r／min，5 h，IPTG濃度為0.5mmol／L，比較適合Agkihpin基因的重組表達；Western blot結(jié)果表明重組Agkihpin蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達，帶有6個His標(biāo)簽，在今后的工作中，可以直接使用Ni2＋親和層析柱快速分離純化目的蛋白，并進行相關(guān)的理化性質(zhì)研究以及生物醫(yī)藥研究；采用T7 Promoter Primer和Agkihpin基因的反向引物進行菌液PCR鑒定，與pET30a（＋）載體相比，不用對菌體進行酶切就能夠判斷目的基因序列是否是正確插入到載體中。重組克隆菌在適宜濃度的IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)過超聲破碎，取離心后的上清跟沉淀一起電泳，從SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖7）可以看到約30KD處出現(xiàn)了明顯的條帶，目的蛋白大量表達了。但SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖7）和Western blot結(jié)果（圖8）均顯示His6-Agkihpin重組蛋白主要以包涵體的形式存在，這可能也是BL21（DE3）能持續(xù)表達His6-Agkihpin原因之一。加入pEASY-E1表達載體上的His-Tag等18個氨基酸殘基后，His6-Agkihpin分子量計算理論值28.07 KD和測量值29.77 KD有一些差距，可能與測量中存在的誤差有關(guān)，還可能與Agkihpin中氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)有關(guān)系。

得到His6-Agkihpin包涵體后，后續(xù)還需對其進行分離、純化和復(fù)性，對重組蛋白的細胞活性和毒性等生物學(xué)功效進行深入的研究，并從分子機制層面進一步論證Agkihpin蛋白藥用的科學(xué)依據(jù)。鑒于目前對Agkihpin蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，其在防治肝癌和鼻咽癌方面具有潛在的藥用價值，本實驗建立的原核表達體系成功表達重組蛋白Agkihpin，對今后量產(chǎn)Agkihpin提供了方法和實驗依據(jù)。

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（編校：吳茜）

Cloning and prokaryotic expression of Agkihpin，a snake venom arginine esterase

ZHU Shu-yu1，HUANG Cheng-xin2，HU Qi-ping1Δ?，HUANGMiao3Δ?，SHUWei1，F(xiàn)ANG Ling1

（1.Department of Cell Biology and Genetics，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.303 Hospital of People's Liberation Army，Nanning 530021，China；3.Department of Radiology，Affiliated Cancer Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

ObjectiveFor providing the methods and evidence for mass product of Agkihpin，a snake venom arginine esterase，to construct prokaryotic expression vectors of Agkihpin，and to induce these vectors to express recombinant Agkihpin by prokaryotic expression system.MethodsAgkihpin gene from venom arginine esterase were used as a template for RT-PCR，and the RT-PCR products were recombined into pET30a（＋）-His6-Agkihpin and pEASY-E1-His6-Agkihpin；then these two recombinant plasmids were transformed and induced in BL21（DE3）competent cells，and the recombinant fusion protein His6-Agkihpin would be detected by SDS-PAGE and Western blot.ResultsAgkihpin gene were successfully constructed in prokaryotic expression vectors，and the recombinant plasmid pEASY-E1-His6-Agkihpin was transformed and expressed in E.coli BL21（DE3）for the first time.A recombinant fusion protein His6-Agkihpin was detected with the molecular weight of 30kD by SDS-PAGE.ConclusionRecombinant fusion protein His6-Agkihpin highly expresss in prokaryotic systems，which provides experimental evidence and methods for drug preparation in the future.

snake venom arginine esterase；thrombin-like enzyme；Agkihpin；prokaryotic expression；clone

Q78；R34

A

1005－1678（2014）09－0033－05

廣西自然科學(xué)基金資助項目（2014GXNSFAA118172）；廣西高校科研項目（2013YB047）

朱書宇，女，碩士在讀，研究方向：蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin相關(guān)生化活性及抗腫瘤作用機制，E-mail：zhushuyuz＠163.com；胡啟平，通信作者，男，博士在讀，副教授，研究方向：蛇毒蛋白抗癌及其機制研究，E-mail：gxmucbghqp07＠yahoo.com.cn；黃秒，共同通信作者，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤影像學(xué)，E-mail：miaomi6660＠sina.com。