邱貞琴，邰秀珍

（1.中國人民解放軍第89醫(yī)院統(tǒng)供中心，山東濰坊261021；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古呼和浩特010110）

不同載體蛋白偶聯(lián)制備促紅細(xì)胞生成素二聚體單克隆抗體的選擇優(yōu)化

邱貞琴1，邰秀珍2

（1.中國人民解放軍第89醫(yī)院統(tǒng)供中心，山東濰坊261021；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古呼和浩特010110）

目的將EPO dimer分別連接牛血清蛋白（bovine serum alumin，BSA）、匙孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）幾個(gè)不同的載體蛋白構(gòu)成抗原，免疫BALB／c小鼠，并結(jié)合特定的ELISA檢測系統(tǒng)，來優(yōu)化選擇抗EPO dimer單克隆抗體。方法采用單克隆抗體制備技術(shù)篩選獲得雜交瘤細(xì)胞；ELISA法鑒定雜交瘤細(xì)胞的特性；分析比較不同載體蛋白構(gòu)建單克隆抗體的差異與效果。結(jié)果共篩選獲得了5株雜交瘤細(xì)胞，5株雜交瘤細(xì)胞均能分泌EPO dimer抗體。經(jīng)過進(jìn)一步的特異性鑒定、亞型鑒定以及效價(jià)鑒定后，有4株雜交瘤細(xì)胞被挑選進(jìn)行大量抗體制備，為后期臨床基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供材料。4株雜交瘤分別為克隆S-18-2，其亞型為IgG2b，κ；克隆S-369-7，其亞型為IgG1，κ；克隆S-410-3，其亞型為IgG1，κ；克隆S-514-7，其亞型為IgG2b，κ；其中克隆S-18-2、S-514-7分泌抗體EPO dimer的能力穩(wěn)定，其抗體對(duì)載體蛋白OVA、KLH、BSA均無效價(jià)，且它們抗原抗體反應(yīng)只針對(duì)EPO dimer；克隆S-369-7、S-410-3分泌抗體EPO dimer的能力也很穩(wěn)定，對(duì)載體蛋白OVA、KLH、BSA也均無效價(jià)，尤其其抗原抗體反應(yīng)可以同時(shí)針對(duì)EPO dimer以及EPO dimer-PEG，即本實(shí)驗(yàn)獲得的這2株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體既可檢測EPO dimer又可檢測EPO dimer-PEG。比較連接BSA、OVA、KLH這幾個(gè)不同載體蛋白構(gòu)建單克隆抗體的差異與效果，發(fā)現(xiàn)以EPO dimer連接載體蛋白OVA獲得的單克隆抗體效果最佳。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)用偶聯(lián)載體的方法增強(qiáng)了小分子EPO dimer的免疫原性，得到了穩(wěn)定分泌EPO dimer抗體的雜交瘤細(xì)胞。

促紅細(xì)胞生成素；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附測定；雜交瘤技術(shù)

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種肽類激素［1-2］。人體中的EPO能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成、刺激幼稚紅細(xì)胞的增生以及紅細(xì)胞蛋白化和紅細(xì)胞的成熟［3-4］?？笶PO的各類抗體可以用于多種疾病的診斷，同時(shí)重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinan thuman erythropoietin，rhEPO）注射液等已經(jīng)成為治療貧血的相關(guān)藥物，被廣泛用于臨床［5-7］。目前國內(nèi)外有較多的多克隆單抗用于檢測促紅細(xì)胞生成素二聚體（EPO dimer）或者聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素二聚體（EPO dimer-PEG），但是同一雜交瘤克隆分泌的抗體既可檢測EPO dimer又可檢測EPO dimer-PEG，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道［8-9］。本實(shí)驗(yàn)旨在將EPO dimer分別與BSA、OVA、KLH幾個(gè)不同的載體蛋白連接構(gòu)成抗原，免疫BALB／c小鼠，結(jié)合ELISA檢測系統(tǒng)，優(yōu)化選擇獲得抗EPO dimer單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：純系6～8周齡雌性BALB／c小鼠15只，體質(zhì)量（22.0±0.9）g，購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：2011A032。動(dòng)物飼養(yǎng)在中科院聚科生物園區(qū)清潔級(jí)動(dòng)物房，按照中科院有關(guān)規(guī)定精心照料、飼養(yǎng)和使用，本研究嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.1.2 主要試劑：EPO dimer粉末購自Merck公司。牛血清蛋白（bovine serum alumin，BSA）和匙孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）購自美國Sigma公司；卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）購自上海伯奧生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)液、8-氮鳥嘌呤、HAT培養(yǎng)基、胎牛血清、聚乙二醇（PEG1450）均購自Sigma公司、胎牛血清（FCS）購自Hyclone公司、HT培養(yǎng)液購自Gibco公司，二甲基亞砜（DMSO）購自Merck公司，mouse sub-isotype panel試劑盒購自Bio-red公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器：96孔培養(yǎng)板購自北京六一儀器廠；ELISA板為NUNC公司產(chǎn)品；AL104電子天平均購自天津市天馬儀器廠；磁力攪拌器購自天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HD-A顯微鏡購自上海滬西分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備：收集經(jīng)8-氮鳥嘌呤篩選過的骨髓瘤SP2／0，顯微鏡下觀察細(xì)胞活性，將活性良好的對(duì)數(shù)增值期的細(xì)胞洗滌后計(jì)數(shù)，細(xì)胞半懸浮在DMEM培養(yǎng)液中備用。飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備。融合前1天，將5mL DMEM培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，輕輕晃動(dòng)后抽出腹腔液，離心，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)／mL，接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，50μL／well。脾臟細(xì)胞的準(zhǔn)備：解剖加強(qiáng)免疫后小鼠，取脾臟，用機(jī)械法分散脾細(xì)胞，經(jīng)濾網(wǎng)過濾得脾細(xì)胞懸液，DMEM培養(yǎng)液洗滌后計(jì)數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞融合：融合過程中小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞比為5∶1。其他均按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行［10］。將2種細(xì)胞混合于離心管中，加入無血清培養(yǎng)液，1500 r／min離心3 min，棄上清。打散沉淀細(xì)胞，逐滴加入1mL的50%PEG，邊加邊搖晃，1min內(nèi)加完；靜止90 s，讓PEG繼續(xù)作用；然后在150 s內(nèi)逐滴加入37℃預(yù)溫的無血清培養(yǎng)液10 mL，靜置5 min，終止PEG作用；融合后細(xì)胞懸液進(jìn)行1000 r／min離心3min；棄上清，將沉淀細(xì)胞輕輕打勻，加入25mL完全培養(yǎng)液，接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞鋪板的96孔板內(nèi)，50μL／well，最后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第2天，加入2×HAT的完全培養(yǎng)液，100μL／well，使孔內(nèi)終濃度為1×HAT，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選。

1.2.3 雜交瘤細(xì)胞的建立：EPO dimer-BSA（EPODi-BSA）：稱取10mg BSA用2mL雙蒸水溶解，得溶液1。1 mLEPO dimer與1m L溶液1混合，將2 m L 0.2%戊二醛溶液加入溶液1中。加完后，將反應(yīng)液于室溫下避光攪拌2 h，再加入1 mL 1 M glycine繼續(xù)于室溫下避光攪拌2 h，得到反應(yīng)物EPOdimer-BSA溶液。PBS透析48 h，－20℃保存?zhèn)溆?。紫外分光光度?jì)測量蛋白濃度為3.2mg／mL。EPO dimer-OVA（EPODi-OVA）：方法同上。紫外分光光度計(jì)測量蛋白濃度為4.6 mg／mL。EPO dimer-KLH（EPODi-KLH）：方法同上。紫外分光光度計(jì)測量蛋白濃度為3.7mg／mL。

以制備的EPO Di-BSA、EPO Di-OVA、EPO Di-KLH為免疫原，100μg／只皮下多點(diǎn)免疫注射BALB／c小鼠共15只，每種抗原5只，免疫4次［11］。具體步驟：同一批次制備的EPO Di-BSA、EPO Di-OVA、EPO Di-KLH以相同劑量加等體積的弗氏佐劑混合，完全乳化后，對(duì)BALB／c小鼠背部皮下及足部進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫。接著再連續(xù)免疫3次，每次間隔3周。第1次免疫用完全弗式佐劑，第2次和第3次用不完全弗氏佐劑。第3次免疫后1周眼眶取血，分離血清，間接ELISA法檢測血清抗體的滴度。融合前3d腹腔注射同樣劑量EPO Di-BSA、EPO Di-OVA、EPO Di-KLH進(jìn)行回憶刺激。

1.2.4 雜交瘤細(xì)胞效價(jià)及其亞型的鑒定：每株雜交瘤細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞加入9mL完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入24.8 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3 d收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液［12］，檢測抗體效價(jià)及其亞型。按mouse sub-isotype panel試劑盒說明書的要求，取雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測。

1.2.5 間接ELISA法檢測：分別用EPO dimer以及EPO dimer-PEG以10μg／mL濃度100μL／well包被96孔ELISA板，3%gelatin封閉2 h，棄去封閉液拍干后依次加入待測上清、同時(shí)加入陽性、陰性對(duì)照，陽性對(duì)照為稀釋過小鼠抗血清，陰性對(duì)照為未用過的干凈培養(yǎng)液。隨后加入HRP-羊抗鼠IgG（酶標(biāo)二抗），孵育及洗滌后，以TMB顯色及2mol／L H2SO4終止反應(yīng)，于450nm處測定OD值。挑選對(duì)EPO dimer有抗體反應(yīng)的培養(yǎng)物分別進(jìn)行克隆化。

1.2.6 細(xì)胞克隆化過程：挑選單個(gè)集落培養(yǎng)物上清ELISA檢測OD450值最高的孔進(jìn)行再克隆，克隆化一般稀釋到10個(gè)／mL，接種至飼養(yǎng)層鋪板的96孔培養(yǎng)板上，100μL／well。待細(xì)胞培養(yǎng)至適當(dāng)大小（一般為20%底板面積），吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA方法再次篩選抗體陽性孔。連續(xù)3次克隆后所有檢測孔均3次達(dá)100%陽性，克隆化過程結(jié)束，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。其他均按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行［13-14］。

2 結(jié)果

2.1 載體蛋白的偶聯(lián) 雙紫外法檢測偶聯(lián)后的蛋白濃度，結(jié)果顯示：EPO dimer蛋白濃度為5.0mg／mL，EPO dimer-BSA蛋白濃度為3.2mg／mL，EPO dimer-OVA蛋白濃度為4.6 mg／mL，EPO dimer-KLH蛋白濃度為3.7mg／mL，EPO dimer-PEG蛋白濃度為3.6 mg／mL。5個(gè)樣品的蛋白濃度均達(dá)到免疫用蛋白的理想濃度。

2.2 抗體效價(jià)檢測 免疫小鼠眼眶取血抗血清對(duì)EPO dimer抗體效價(jià)測定結(jié)果如表1。抗血清從1∶2000開始倍比稀釋。表中以EPO Di-KLH＃4小鼠抗體效價(jià)為64000，EPO Di-OVA＃1小鼠抗體效價(jià)為64000，EPO Di-OVA＃5小鼠抗體效價(jià)為32000。這3只小鼠為構(gòu)建雜交瘤時(shí)脾細(xì)胞供體的首選，其他小鼠免疫效果均不理想，不適合構(gòu)建雜交瘤。

2.3 細(xì)胞融合與克隆化 細(xì)胞融合小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合后抗體檢測的陽性結(jié)果見表2。EPODi-OVA為免疫原的＃1小鼠脾臟與骨髓瘤融合率為89.5%，抗EPO dimer抗體的陽性率為8.10%。EPO Di-KLH為免疫原的＃4小鼠脾臟與骨髓瘤融合率為91.4%，抗EPO dimer抗體的陽性率為3.64%。2次融合的融合率都符合此骨髓瘤的特性，EPO Di-OVA＃1小鼠的陽性率高于EPO Di-KLH＃4小鼠，即檢測所得的陽性孔數(shù)量多，克隆后獲得的克隆數(shù)量也會(huì)相應(yīng)增多。

由EPO Di-OVA免疫的mouse＃1脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合獲得的5株雜交瘤克隆細(xì)胞（見表3）。S-18-2在克隆化過程中的克隆率都小于2／3，陽性率達(dá)到3次100%，說明它能穩(wěn)定分泌抗EPO dimer抗體。S-87-8在克隆化過程中的克隆率都小于2／3，陽性率達(dá)到3次100%，說明它能穩(wěn)定分泌抗EPO dimer抗體。S-233-11在克隆化過程中的克隆率都小于2／3，陽性率達(dá)到3次100%，說明它能穩(wěn)定分泌抗EPO dimer抗體。S-306-13在克隆化過程中的克隆率都小于2／3，陽性率達(dá)到3次100%，說明它能穩(wěn)定分泌抗EPO dimer抗體。S-369-7在克隆化過程中的克隆率都小于2／3，陽性率達(dá)到3次100%，說明它能穩(wěn)定分泌抗EPO dimer抗體。

表3 5株雜交瘤克隆細(xì)胞的克隆化結(jié)果Tab.3 Cloning results 5 strains hybridoma clones of cells

表1 免疫小鼠眼眶取血抗血清對(duì)EPO dimer抗體效價(jià)測定Tab.1 Determination of EPO dimer antibody titer of immunized mice with orbital blood antiserum

2.4 雜交瘤細(xì)胞的特性鑒定 5株雜交瘤克隆擴(kuò)增凍存，并以1×106細(xì)胞加入9mL培液，培養(yǎng)3 d，收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，檢測抗體效價(jià)及其亞型（見表4）。由于雜交瘤是通過偶聯(lián)載體進(jìn)行免疫制備的，在特性鑒定的時(shí)候需要檢測其對(duì)載體蛋白的抗體效價(jià)?？寺-18-2，克隆S-18-2分泌的抗體只針對(duì)EPO dimer有抗原抗體反應(yīng)。克隆S-87-8，克隆S-233-11，克隆S-306-13分泌的抗體分泌的抗體針對(duì)EPO dimer、EPO dimer-PEG均有抗原抗體反應(yīng)。

表4 5雜交瘤細(xì)胞的特性鑒定結(jié)果Tab.4 Characterization results of 5 hybridoma cells

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用偶聯(lián)載體的方法增強(qiáng)了小分子EPO dimer的免疫原性，得到了穩(wěn)定分泌EPO dimer抗體的雜交瘤，取得了良好的效果。由此總結(jié)：第一，選擇正確的載體才能成功免疫和制備分泌小分子抗體的雜交瘤。本實(shí)驗(yàn)分別用BSA、OVA、KLH 3種載體蛋白偶聯(lián)EPO dimer作為免疫原，最后優(yōu)化選擇偶聯(lián)OVA與KLH的免疫小鼠作為脾細(xì)胞供體進(jìn)行雜交瘤構(gòu)建，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)載體蛋白OVA的構(gòu)建效果最佳。對(duì)于其他的小分子如需構(gòu)建雜交瘤，可以借鑒文獻(xiàn)報(bào)道，也可以同本實(shí)驗(yàn)一樣進(jìn)行優(yōu)化選擇。第二，構(gòu)建此類小分子抗體雜交瘤需要建立穩(wěn)定可靠的ELISA檢測系統(tǒng)，整個(gè)系統(tǒng)需確定有效的陰性對(duì)照以及陽性對(duì)照值，這在雜交瘤的篩選過程中起著重要作用。第三，用載體蛋白偶聯(lián)小分子為免疫原比單純將小分子聚合作為免疫原所獲得的雜交瘤特性更豐富多變，這可能與分子量的增加，分子結(jié)構(gòu)變化所致的結(jié)合位點(diǎn)的變化有關(guān)［15］。

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（編校：吳茜，王儼儼）

Preparation ofmonoclonal antibodies EPO dimer by hybridoma technique coup ling w ith different carrier

QIU Zhen-qin1，TAIXiu-zhen2

（1.Department of System for Center，People's Liberation Army of Eighty-ninth Hospital，Weifang 261021，China；2.Department of Clinical Medicine，Inner Mongolia Medical University，Huhehaote 010110，China）

ObjectiveTo connect EPO dimer with several different carrier protein antigen，BSA，OVA，and KLH，respectively，immune BALB／c mice，combined with the specific ELISA detection system，and optimize selection for resistance to EPO dimer monoclonal antibodies.MethodsHybridoma cells selected by an antibodies response against EPO dimer were cloned；hybridoma cell properties were identified by ELISA method，and the difference and effect of monoclonal antibodies constructed with different carrier were compared.ResultsBy monoclonal antibodies preparation technology，5 strains hybridoma were screened，5 hybridoma cells could secrete the EPO dimer antibodies.5 strains hybridomacells after further specific subtype identification，identification and titer evaluation，there were 4 strains hybridoma cells selected to prepare a large number ofantibodies，and provide clinicalbasic experimentmaterials.Four strains hybridoma cells：cloning S-18-2，the subtype of IgG2b，kappa；cloning S-369-7，the subtype of IgG1，kappa；cloning S-410-3，the subtype of IgG1，kappa；cloning S-514-7，the subtype of IgG2b，kapp.The cloneing S-18-2，S-514-7 secreted antibodies EPO dimer and the ability were stable，the antibodies to carrier protein OVA，KLH，BSA were void，and their antigen antibodies responsed only for EPO dimer；cloning S-369-7，S-410-3 secreted antibodies EPO dimer and the ability were also very stable，the carrier protein OVA，KLH and BSA were also invalid titer，the most important thing was：the antigen-antibodies reaction could simultaneously aim at EPO dimer and EPO dimer-PEG，that the secreting antibodies of2 strains hybridoma cells could detect EPO dimer and EPO dimer-PEG.Comparation results of the difference and effectofmonoclonal antibodies constructed with different carrier showed that itwas optimum while EPO dimer was connected with carrier protein OVA.Conclusion The smallmolecule EPO dimer coupling vector could enhance immunogenicity，and obtain the hybridoma cellsthat stable secretes EPO dimer antibodies.

erythropoietin；monoclonal antibodies；ELISA；hybridoma technique

R446.61

A

1005－1678（2014）08－0088－04

2012年國家自然科學(xué)基金（81260414）

邱貞琴，女，本科，主任醫(yī)師，研究方向：藥學(xué)及藥學(xué)管理，E-mail：qch1821460035＠163.com。