黨帥，張紅梅

（1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河南南陽(yáng)473009；2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原030001）

細(xì)胞色素P450 2E1在尼古丁致神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷中的作用

黨帥1，張紅梅2

（1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河南南陽(yáng)473009；2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原030001）

目的本文擬采用體外實(shí)驗(yàn)，探討腦細(xì)胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1，CYP 2E1）在尼古丁致神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷中的可能作用。方法實(shí)驗(yàn)選用IMR-32人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，設(shè)置對(duì)照組，尼古丁小劑量組（0.1 nM）、中劑量組（1 nM）和大劑量組（10 nM），并選用中劑量尼古丁加入不同劑量CYP2E1特異性抑制劑二丙烯基硫醚（diallyl sulfide，DAS）（0.025、0.05、0.075 nM）。尼古丁或尼古丁與二丙烯基硫醚處理細(xì)胞48 h。取處理后細(xì)胞，分別檢測(cè)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、CYP2E1mRNA和蛋白水平的變化，并對(duì)CYP2E1蛋白表達(dá)水平與LDH活力、SOD活力、ROS含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果與對(duì)照組相比，經(jīng)低、中、高劑量尼古丁處理后，IMR-32細(xì)胞增殖受抑制，抑制率分別為39%、47%、52%（均P＜0.05）；細(xì)胞受到損傷，培養(yǎng)基LDH活力分別升高14%、50%、70%（均P＜0.05）；SOD活力下降至對(duì)照組的76%、58%、44%（均P＜0.05）；細(xì)胞CYP2E1蛋白表達(dá)水平顯著升高至2.19、2.65及2.76倍（均P＜0.05），未見(jiàn)CYP2E1mRNA水平改變；ROS生成量升高48%、65%、136%（均P＜0.05）。與尼古丁（1 nm）組相比，加入低、中、高劑量抑制劑后，SOD活力升高24%、47%、52%（均P＜0.05）；ROS含量下降至77.8%、57.8%、44.3%（均P＜0.05）。相關(guān)性分析顯示，CYP2E1含量與LDH活力呈正相關(guān)，與SOD活力呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.740和－0.584，與ROS含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.695（均P＜0.01）。結(jié)論尼古丁處理可抑制IMR-32細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腦CYP2E1表達(dá)，明顯誘導(dǎo)ROS生成，致神經(jīng)細(xì)胞損傷。

尼古??；細(xì)胞色素P450 2E1；自由基；神經(jīng)細(xì)胞

尼古丁，又名煙堿，主要存在于煙草中，是廣泛濫用的物質(zhì)之一。近年來(lái)吸煙的危害越來(lái)越受到人們重視。大量科學(xué)研究證明，吸煙對(duì)人體的循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等，均產(chǎn)生有害作用，其致病機(jī)理正在研究［1］。中國(guó)是世界上最大的煙草生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，煙草產(chǎn)量占世界總量的1／3。至2006年末，我國(guó)吸煙者達(dá)3.5億，占全球吸煙總?cè)藬?shù)的1／3，被動(dòng)吸煙者5.4億，每年約有100萬(wàn)人死于吸煙相關(guān)疾病。預(yù)計(jì)到2020年我國(guó)每年有200萬(wàn)人死于吸煙相關(guān)疾?。?］。IMR-32細(xì)胞來(lái)源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，可表達(dá)CYP2E1，也用于乙醇和尼古丁的靶位——GABAA受體和煙堿型乙酰膽堿受體的研究［3-4］。本文采用IMR-32細(xì)胞系，研究不同濃度的尼古丁對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷與CYP2E1表達(dá)水平的影響，探討腦CYP2E1在神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷中的毒理學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 尼古丁，DCF-DA，DAS，DMSO，多聚賴(lài)氨酸均購(gòu)于美國(guó)sigma公司；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；抗生素（青霉素＋鏈霉素）購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；MEM培養(yǎng)基，胰酶（含EDTA）購(gòu)于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；量子點(diǎn)超敏熒光試劑盒購(gòu)于武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；吐溫-80購(gòu)于湖北大學(xué)化工廠；冰乙酸購(gòu)于鄭州市化學(xué)試劑三廠；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉購(gòu)于上海市新華化工廠；氯化鈉購(gòu)于開(kāi)封市化學(xué)試劑二廠。

1.2 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；倒置顯微鏡（日本Olympus）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；UV-1601紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；SHZ-82型水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；－80℃超低溫冰箱（海爾集團(tuán)）；激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)（德國(guó)Leica）；熒光顯微鏡（日本Olympus）；Real-time PCR Detection System（SLAN，HONGSHI）；ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)選用IMR-32人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，設(shè)置對(duì)照組，尼古丁小劑量組（0.1 nM）、中劑量組（1 nM）和大劑量組（10 nM），并選用中劑量尼古?。? nM）加入不同劑量CYP2E1特異性抑制劑二丙烯基硫醚（0.025，0.05，0.075 nM）。尼古丁或尼古丁與二丙烯基硫醚處理細(xì)胞48 h。取處理后細(xì)胞，分別檢測(cè)LDH、SOD的變化。

ROS：細(xì)胞爬片，藥物處理48 h后，用PBS緩沖液洗細(xì)胞1次，加入含0.05 nM DCF-DA的無(wú)色培養(yǎng)基孵育，體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜。培養(yǎng)箱內(nèi)37℃，5%CO2培養(yǎng)1.5 h，吸棄負(fù)載液，PBS漂洗（3×3min）。在LSCM上，用488 nm激光激發(fā)，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，掃描20 s左右待細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度平穩(wěn)后，記錄此時(shí)熒光值。用不含DCF-DA的細(xì)胞作為空白對(duì)照，以排除自發(fā)熒光的干擾；以樣品的熒光強(qiáng)度值減去空白值作為絕對(duì)熒光強(qiáng)度值，未經(jīng)處理的細(xì)胞的絕對(duì)熒光強(qiáng)度值記為100%，其余各組熒光強(qiáng)度值與之相比得到各自的相對(duì)活性氧強(qiáng)度值。

CYP2E1mRNA：參照ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA鏈，反應(yīng)總體積為20μL，其中樣品RNA 2μL，ReverTra Ace 1μL。42℃反應(yīng)20min，95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min，反應(yīng)產(chǎn)物-20℃保存待用。Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系25μL，其中SYBR Green mix 12.5μL，cDNA（5倍稀釋?zhuān)?.5μL。95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸45 s，40次循環(huán)擴(kuò)增，以β-actin作內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳分離，80V電壓電泳35min，結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察有無(wú)目標(biāo)條帶，拍照。運(yùn)用2-△△CT法分析熒光定量PCR結(jié)果，并對(duì)CYP2E1蛋白表達(dá)水平與LDH活力、SOD活力、ROS含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)CYP2E1表達(dá)水平與LDH活力、SOD活力以及ROS水平進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算皮爾遜相關(guān)分析系數(shù)，并采用Fisher檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尼古丁對(duì)IMR-32細(xì)胞損傷及對(duì)LDH水平的影響正常IMR-32細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)，有聚集生長(zhǎng)的特性，培養(yǎng)瓶底部干凈清晰；經(jīng)尼古丁處理后，細(xì)胞有回縮為圓形的趨勢(shì)，部分細(xì)胞脫落，瓶底出現(xiàn)細(xì)胞碎片或其他雜質(zhì)（見(jiàn)圖1）。與對(duì)照組相比，經(jīng)低、中、高劑量尼古丁處理，培養(yǎng)基LDH活力顯著升高。經(jīng)0.1、1、10 nM尼古丁處理細(xì)胞48 h后，培養(yǎng)基中LDH活力分別是對(duì)照組的1.14、1.50和1.70倍（均P＜0.05）。

圖1 尼古丁對(duì)IMR-32細(xì)胞損傷及對(duì)LDH水平的影響Fig.1 Effects of nicotine treatment on LDH levels in IMR-32 neuroblastoma cells

2.2 尼古丁抑制IMR-32細(xì)胞增殖 MTT實(shí)驗(yàn)顯示，尼古丁可明顯抑制細(xì)胞增殖，濃度為0.1、1、10 nM時(shí)的活躍度依次為61%，53%，48%（均P＜0.05，見(jiàn)圖2）。

圖2 不同劑量尼古丁對(duì)IMR-32細(xì)胞增值的影響Fig.2 Effects of nicotine on proliferation of IMR-32 neuroblastoma cells in a dose-dependentmanner

2.3 尼古丁／尼古?。獶AS對(duì)IMR-32細(xì)胞SOD活性的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低、中、高劑量的尼古丁均可使細(xì)胞SOD活力下降，經(jīng)0.1、1、10 nM尼古丁處理后，培養(yǎng)基中SOD活力分別是對(duì)照組的76%、58%和44%（均P＜0.05）；加入低、中、高劑量的DAS處理后，細(xì)胞SOD活力升高，經(jīng)0.025、0.05、0.075 nM DAS處理后，SOD活力分別升高至尼古?。? nM）組的1.24、1.47和1.52倍（均P＜0.05）。

2.4 尼古丁對(duì)IMR-32細(xì)胞CYP2E1蛋白水平的影響 免疫熒光化學(xué)檢測(cè)顯示，經(jīng)0.1、1、10 nM尼古丁處理細(xì)胞48 h后，IMR-32細(xì)胞CYP2E1表達(dá)明顯增加，分別升高至對(duì)照組的2.19、2.65及2.76倍（均P＜0.05，見(jiàn)圖3）。

圖3 尼古丁對(duì)IMR-32細(xì)胞CYP2E1蛋白水平的影響Fig.3 Effects of nicotine treatment on CYP2E1 levels in IMR-32 neuroblastoma cells

2.5 尼古丁對(duì)IMR-32細(xì)胞CYP2E1 mRNA水平的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，尼古丁0.1、1、10 nM處理IMR-32細(xì)胞48 h，CYP2E1 mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)升高（見(jiàn)圖4）。

圖4 尼古丁對(duì)IMR-32細(xì)胞CYP2E1 mRNA水平的影響Fig.4 Effects of nicotine treatment on CYP2E1 mRNA levels in IMR-32 neuroblastoma cells

2.6 尼古丁及DAS對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響 與對(duì)照組相比，經(jīng)0.1、1、10 nM尼古丁處理48 h后，IMR-32細(xì)胞中ROS含量分別升高1.48、1.65、2.36倍（均P＜0.05）；與尼古丁（1 nM）組相比，經(jīng)0.025、0.05、0.075 nM DAS處理后，ROS含量降低至77.8%、57.8%、44.3%（均P＜0.05）。

2.7 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析可知，CYP2E1含量與LDH活性呈正相關(guān)，與SOD活性呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.740（P＜0.01）和－0.584（P＜0.01），與ROS含量正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.695（P＜0.01）。

3 討論

本文觀察了不同劑量尼古丁對(duì)IMR-32細(xì)胞CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，并觀察了CYP2E1特異性抑制劑DAS，對(duì)尼古丁誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生以及細(xì)胞氧化損傷的影響。結(jié)果表明，尼古丁處理可抑制IMR-32細(xì)胞增殖，產(chǎn)生細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)ROS生成及CYP2E1表達(dá)，且均表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，但對(duì)mRNA水平無(wú)影響；抑制CYP2E1活性，可明顯減少ROS生成。尼古丁誘導(dǎo)細(xì)胞ROS生成機(jī)制尚不清楚［5-7］，本研究結(jié)果提示尼古丁致細(xì)胞ROS升高可能與其誘導(dǎo)CYP2E1水平相關(guān)。尼古丁可劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)IMR-32細(xì)胞ROS生成。相對(duì)于其他CYP亞型，CYP2E1具有較高的NADPH氧化活性，這是由于CYP2E1蛋白空間結(jié)構(gòu)具有可變性，由于CYP2E1蛋白構(gòu)型的高速變化，底物與活性位點(diǎn)僅有短暫結(jié)合時(shí)間以進(jìn)行活性氧轉(zhuǎn)移。尼古丁誘導(dǎo)CYP2E1后ROS產(chǎn)生增多，是否與上述信號(hào)通路激活有關(guān)需進(jìn)一步研究［8-11］。當(dāng)ROS生成增多時(shí)，機(jī)體會(huì)調(diào)動(dòng)復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)來(lái)保證生物體內(nèi)氧化——抗氧化的平衡，抗氧化系統(tǒng)主要由抗氧化酶類(lèi)和抗氧化劑組成，如SOD。IMR-32細(xì)胞經(jīng)尼古丁處理后，SOD活力下降，提示尼古丁產(chǎn)生的ROS引起了SOD的耗損［12-14］。當(dāng)ROS含量超過(guò)機(jī)體清除能力時(shí)，則產(chǎn)生氧化損傷［15］。本實(shí)驗(yàn)觀察到培養(yǎng)基LDH活力升高，提示IMR-32細(xì)胞經(jīng)尼古丁處理后細(xì)胞膜受到損傷。尼古丁處理可抑制IMR-32細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)CYP2E1蛋白表達(dá)，ROS生成增多，并表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，相關(guān)性分析提示，CYP2E1表達(dá)水平與IMR-32細(xì)胞ROS含量顯著相關(guān)；尼古丁通過(guò)CYP2E1對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的機(jī)制以及誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1表達(dá)的機(jī)制，以及尼古丁暴露時(shí)間對(duì)CYP2E1作用的差異尚需進(jìn)一步研究。

本文結(jié)果表明，尼古丁可劑量依賴(lài)性抑制IMR-32細(xì)胞增殖，在轉(zhuǎn)錄后水平誘導(dǎo)CYP2E1蛋白表達(dá)，ROS生成增多；抑制腦CYP2E1活性，可明顯減少ROS生成量。相關(guān)性分析提示，CYP2E1可能參與尼古丁致神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷。

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（編校：譚玲，劉路路）

Roles of cytochrome P450 2E1 in neural cell of nicotine-induced oxidative injury

DANG Shuai1，ZHANG Hong-mei2

（1.Department of Neurosurgery，Center Hospital of Nanyang，Nanyang 473009，China；2.ShanxiMedical University，Taiyuan 030001，China）

ObjectiveTo investigate roles of CYP2E1 in neural cell damage induced by nicotine treatment.MethodsIn this study，IMR-32 neuroblastoma cells were cultured.Those cellswere ramdom ly divided into control group，low dose ofnicotine group，middle dose of nicotine group，and high dose of nicotine group.Those nicotine groupswere treated with nicotine（0.1，1 and 10 nM），whilemiddle dose of nicotine group was co-treated with nicotine（1 nM）and dially sulfide（0.025，0.05 and 0.075 nM）for48 hours.After treatment，levels of ROS，SOD，CYP2E1 protein and CYP2E1 mRNA were detected.The relationship between CYP2E1 protein levels and LDH，SOD，ROS levels were analysed by correlation analysis.ResultsCompared with control group，the results of nicotine groups showed that proliferation of IMR-32 neuroblastoma cells were suppressed after the treatment of low dose of nicotine，middle dose of nicotine and high dose of nicotine，and the suppression ratios were 39%，47%，52%respectively（all P＜0.05）.The lactate dehydrogenase significantly increased（1.14-fold，1.5-fold，1.7-fold，all P＜0.05），and superoxide dismutase significantly decreased to 76%，58%and 44%of control group（all P＜0.05）.The expression of CYP2E1 protein significantly increased（2.19-fold，2.65-fold，2.76-fold），and the levels of ROS significantly increased（1.48-fold，1.65-fold，2.36-fold）（all P＜0.05），while CYP2E1 mRNA did not change significantly.Compared withmiddle dose of nicotine group（1 nM），the levels of ROS decreasd（88.5%，79.9%，51.2%）and SOD increased（1.24-fold，1.47-fold，1.52-fold）after treatmentwith DAS（0.025，0.05 and 0.075 nM）.Correlation analysis demonstrated that CYP2E1 levelwas correlated to LDH（0.740），SOD（－0.584）and ROS（0.695）levels（all P＜0.01）.Conclusion Nicotine treatment could inhibit the proliferation of IMR-32 cells，induce brain CYP2E1 expression，induce ROS generation，and induce damage to nerve cells.

nicotine；cytochrome P450 2E1（CYP2E1）；ROS；neural cell

R966

A

1005－1678（2014）08－0034－04

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金（20091417120003）

黨帥，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：顱腦損傷及腦血管病臨床研究，E-mail：dangs＠126.com。