肖幼華 李 榮 蔡聯(lián)明 謝旭平 盧致洋 陳漢民 王冬梅 雷先華

結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變是結(jié)直腸癌的癌前病變，是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的一個(gè)病理階段，是一個(gè)新的病理診斷名詞，各級(jí)醫(yī)院均已普遍使用這一診斷名詞，其病變限于黏膜上皮或只侵犯固有膜而沒(méi)有通過(guò)黏膜肌層到黏膜下層，無(wú)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)。治療方法主要是局部手術(shù)治療。有文獻(xiàn)報(bào)道，術(shù)前50%～90%的結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變，術(shù)后被證實(shí)為結(jié)直腸癌，而結(jié)直腸癌，則需要采用根治性手術(shù)。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤，腺瘤及腺癌LGR5蛋白表達(dá)水平可將上皮內(nèi)瘤變與腺癌區(qū)別開(kāi)來(lái)，從而選擇正確的外科治療方法。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集贛州市腫瘤醫(yī)院2011年-2012年住院及門(mén)診病例，其中結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變60例(腺瘤合并高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變32例，腺瘤合并低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變28例)其中有3例合并腺癌，男性46例，女性24例，年齡29～79歲，隨機(jī)選取腺瘤10例，男性6例，女性4例，年齡37～69歲，均取自電切或手術(shù)切除標(biāo)本。高分化腺癌20例，男性11例，女性9例，年齡30～70歲，均取自同期手術(shù)切除標(biāo)本。各組臨床病理資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無(wú)差異。

1.2 主要試劑

兔腸上皮干細(xì)胞蛋白單克隆抗體Anti- LGR5及SP-0023免疫試劑盒，均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

厚4 μm 的石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精再水化。置CBS(pH6.0)高壓熱修復(fù)20 min，自然冷卻，PBS沖洗3 次，每次3 min。加LGR5 一抗，37 ℃溫箱孵育1 h。PBS 沖洗3 次，滴加二抗，37 ℃水浴箱孵育20 min，PBS 沖洗3 次。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，封片，在顯微鏡下觀察攝片。用PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，用經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證的已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

LGR5以胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性染色。高倍鏡下(× 200)每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200 個(gè)腫瘤細(xì)胞，共1 000 個(gè)，計(jì)算陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。腫瘤細(xì)胞無(wú)著色為(-)； 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)< 25% 為(+)； 25%～50%為(++)；> 50%為(+++)。所有切片均由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法做出判斷。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。免疫組化檢測(cè)數(shù)據(jù)行Fisher精確檢驗(yàn)，Pearson Chi-square檢驗(yàn)。以P<0.05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組織中LGR5表達(dá)情況

LGR5 免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色細(xì)顆粒狀，細(xì)胞核和細(xì)胞膜幾乎不著色。結(jié)直腸腺瘤中LGR5陽(yáng)性表達(dá)率為40.00%(4/10)，上皮內(nèi)瘤變中其陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%(50/60)，腺癌為100.00%(20/20)，見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變、腺瘤、腺癌中LGR5表達(dá)情況/例

2.2 LGR5表達(dá)與結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變病理分級(jí)的關(guān)系

LGR5在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組和低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為84.37%(27/32)、82.14%(23/28)，結(jié)果表明LGR5表達(dá)水平與結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變病理分級(jí)無(wú)相關(guān)性(表2)。

表2 LGR5表達(dá)與結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變病理分級(jí)的關(guān)系/例

3 討論

LGR5(rich in leucine repeated units of G protein coupled receptor 5)屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族，可在胃腸道、毛囊等多種組織表達(dá)。新近研究表明LGR5是Wnt通路的目標(biāo)基因，與R-脊蛋白結(jié)合能夠增強(qiáng)Wnt/B-catenin信號(hào)，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)LGR5表達(dá)陽(yáng)性的干細(xì)胞是結(jié)直腸癌的起始細(xì)胞，作為潛在的結(jié)直腸干細(xì)胞標(biāo)志物的LGR5在結(jié)直腸癌中大量表達(dá)[1-2]。結(jié)直腸癌發(fā)生的病理過(guò)程，是從腺瘤—上皮內(nèi)瘤變—腺癌的過(guò)程，結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變作為結(jié)直腸癌的癌前病變，是腺瘤轉(zhuǎn)變?yōu)橄侔┑囊粋€(gè)重要環(huán)節(jié)。檢測(cè)LGR5在結(jié)直腸癌不同病理階段的表達(dá)，有助于結(jié)直腸癌的早期診斷[3]。

有資料表明LGR5可促進(jìn)結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生，從而促進(jìn)腺瘤向上皮內(nèi)瘤變，腺癌的轉(zhuǎn)變[4-5]。Becker等[6]運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法比較正常結(jié)腸、癌前病變以及結(jié)腸腺瘤LGR5的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，正常的組織中LGR5在隱窩基底部表達(dá)，而在癌前病變的組織中LGR5的表達(dá)并不局限于隱窩基底部且表達(dá)量較高，結(jié)腸腺瘤中LGR5較少在基底部表達(dá)，而是在腺腔的表面大量表達(dá).此研究表明LGR5是人腸道干細(xì)胞的一個(gè)潛在標(biāo)志物，其失巢表達(dá)是干細(xì)胞向癌前病變轉(zhuǎn)變的早期事件，并在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。本研究中，在腺瘤，上皮內(nèi)瘤變，腺癌當(dāng)中均能檢出LGR5，說(shuō)明腺瘤，上皮內(nèi)瘤變，腺癌的發(fā)生均來(lái)源于結(jié)直腸干細(xì)胞。

本研究還發(fā)現(xiàn)LGR5在腺瘤，上皮內(nèi)瘤變，腺癌中的表達(dá)水平不一致。腺瘤表現(xiàn)為陰性和陽(yáng)性，在上皮內(nèi)瘤變表現(xiàn)陽(yáng)性和中陽(yáng)性，在腺癌中表現(xiàn)為中陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中有3例上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本取自距腺癌4～10 cm，均表現(xiàn)為中陽(yáng)性，且腺癌組織表現(xiàn)為中陽(yáng)性，兩者完全吻合，說(shuō)明這3例標(biāo)本也已癌變。

有資料表明，術(shù)前50%～90%的結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變，術(shù)后被證實(shí)為結(jié)直腸癌[7]。利用LGR5在腺瘤，上

皮內(nèi)瘤變，腺癌中的表達(dá)水平不一致這一特點(diǎn)，我們可以用于上皮內(nèi)瘤變的鑒別診斷，是上皮內(nèi)瘤變，還時(shí)腺癌，為外科醫(yī)生選擇手術(shù)方式提供依據(jù)。本研究中10例LGR5表達(dá)陰性及30例表達(dá)陽(yáng)性者，均為上皮內(nèi)瘤，手術(shù)采取電切術(shù)，局部切除術(shù)。18例表達(dá)中陽(yáng)性者，有9例是腺癌，50%的中陽(yáng)性患者需行根治性手術(shù)，還有50%的中陽(yáng)性患者則需腸段切除術(shù)。許多研究表明LGR5在癌組織及癌旁組織大量表達(dá)[1]，對(duì)于結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變中LGR5表達(dá)中陽(yáng)性者，就給予腸段切除或根治性手術(shù)。高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中，1例表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性者，經(jīng)局部切除后，術(shù)后病理診斷為腺癌，而行二次手術(shù)。低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中，1例表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性者，術(shù)前為腺瘤，行局部切除，術(shù)后為低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，術(shù)后8個(gè)月，轉(zhuǎn)變?yōu)橹蹦c癌，而行Miles手術(shù)。

綜上所述，對(duì)于術(shù)前病理診斷為結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤變，加做LGR5檢測(cè)，根據(jù)LGR5表達(dá)水平不同，可以鑒別是瘤變，還是腺癌，LGR5是鑒別結(jié)直腸上皮內(nèi)瘤的良好的免疫組化指標(biāo)，為選外科手術(shù)方式提供重要的參考依據(jù)，避免了行二次腸鏡，二次病理活檢，二次手術(shù)。

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