周媛媛 李超彥 李 立

(漯河醫(yī)學高等?？茖W?；A(chǔ)醫(yī)學部，河南 漯河 462002)

人參皂甙(GS)是人參的主要藥理活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老和減輕神經(jīng)功能損傷的作用，作為中藥復方制劑的主要成分之一已應用于腦血管疾病的治療〔1〕；但GS包含較多單體如Rb1、Rd、Re、Rg1、Rg3等，故對其單體藥理活性的研究顯得尤為重要〔2〕。目前缺血性腦血管病的實驗研究中多以青年動物為對象，忽視了人類腦血管疾病中年齡增長因素的重要性，對探討老年缺血性腦血管病病理生理特點及指導臨床防治方面有一定的不足。本實驗采用老齡腦缺血再灌注損傷(IRI)大鼠模型，研究GS單體Rg1對腦IRI大鼠腦功能的保護作用及谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)含量的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級Wistar大鼠，雌雄不拘，15月齡48只，體重350～390 g，由鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供(合格證號：20110020)；GS Rg1由上海同田生物技術(shù)有限公司提供(批號：10110619)，使用前用生理鹽水按0.1ml/kg配成合適濃度后給藥；血栓通注射液由雅安三九藥業(yè)制藥有限公司提供(批號：1011009)；MSE-25型高速冷凍離心機(上?？茖W儀器廠)，電子天平(梅特勒AL10401)，超低溫冰箱(美國ThermoForma702)，Waters高效液相色譜儀(Waters公司)，721-分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.2動物分組 大鼠適應性飼養(yǎng)1 w，自由飲食；隨機分為假手術(shù)組、模型組、低劑量、中劑量、大劑量GS Rg1組及血栓通組，每組8只。術(shù)前5 d腹腔注射GS Rg1低、中、高劑量分別為10、20、40 mg/kg，血栓通注射液0.45 mg/kg，造模前0.5 h靜脈給藥1次，造模后4 h和10 h分別再進行腹腔注射給藥。模型組及假手術(shù)組給以等量生理鹽水腹腔注射。

1.3動物模型制備 參照Longa等〔3〕方法建立大鼠中動脈阻塞模型。大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，沿頸部正中切開，分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈；用絲線結(jié)扎右頸總及頸外動脈，在頸內(nèi)動脈處預先打一松結(jié)；在右頸總動脈分叉處剪一V形缺口，將阻塞線由切口插入并輕推至頸內(nèi)動脈處，結(jié)扎預置的松結(jié)；隨后碘伏消毒，縫合皮膚。缺血2 h后，大鼠再次麻醉后，剪開切口，將阻塞線退出至頸內(nèi)動脈頸段以實現(xiàn)缺血后再灌注，消毒及縫合皮膚。

1.4造模成功標準 取造模大鼠側(cè)腦切片行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，變白色為模型成功。術(shù)后實驗動物出現(xiàn)左側(cè)眼瞼下垂，眼球凹陷，不能完全伸展左側(cè)前肢及行走時向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈。符合上述標準且存活24 h者作為實驗對象，立即進行行為學評分并取腦組織備用。

1.5行為學評分 按照Longa等〔3〕神經(jīng)功能缺損評分法評分。0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。神經(jīng)功能缺損評分時間點同上。

1.6腦梗死范圍測定 將造模后存活24 h大鼠，快速取出兩側(cè)大腦半球，冰凍20 min后于大腦中間取冠狀切面腦組織切片，置于TTC中，15 min后以4%甲醛固定。以BI2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)計算腦梗死面積百分比。

1.7病理學檢查 大腦中間取冠狀切面腦組織切片，4%甲醛固定，脫水，石蠟包埋后切片，行HE染色。光鏡下觀察組織病理學變化。

1.8腦組織勻漿制備 取剩余大腦半球顳葉，制成10%腦組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液置-20℃冰箱備用。以高效液相色譜法學進行Glu和Asp含量測定。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1GS Rg1對大鼠腦梗死面積及神經(jīng)行為學評分的影響 與假手術(shù)組比較，模型組行為學評分顯著升高(P<0.01)，腦梗死面積顯著增大(P<0.01)；與模型組比較，GS Rg1中、大劑量組及血栓通注射液組行為學評分顯著降低(P<0.05)，腦梗死面積均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 GS Rg1對大鼠腦梗死面積及行為學評分的影響

2.2GS Rg1對腦組織Glu、Asp含量的影響 與假手術(shù)組比較，IR 24 h后模型組Glu和Asp顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，GS Rg1中、大劑量組及血栓通組Asp含量明顯降低(P<0.05)，GS Rg1中劑量組Glu含量明顯降低(P<0.05)，GS Rg1大劑量組及血栓通組Glu含量明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 GS Rg1對腦組織Glu、Asp含量的影響

2.3腦組織形態(tài)學改變 光鏡下可見假手術(shù)組腦組織無明顯缺血性病理改變，各類細胞胞質(zhì)胞核界限清晰；模型組腦組織缺血再灌注區(qū)域可見神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞出現(xiàn)腫脹變形，胞質(zhì)胞核界限不清，部分胞核固縮、核膜模糊核仁不清或者消失，細胞間質(zhì)疏松水腫、間隙變寬，可見少量炎癥細胞浸潤，呈現(xiàn)缺血性病理改變。各GS Rg1劑量組中隨劑量增大可見腦組織IRI程度明顯減輕，細胞核及細胞膜輪廓漸清晰，間質(zhì)水腫減輕。血栓通組腦組織光鏡變化可見類似于GS Rg1大劑量組的表現(xiàn)。

3 討 論

腦IRI涉及極其復雜的病理生理過程，其中各個環(huán)節(jié)、各種影響因素間的相互作用尚未完全闡明〔4〕。目前研究顯示缺血期間升高的Glu、Asp等興奮性氨基酸的興奮毒性在神經(jīng)細胞損傷及引發(fā)的腦功能障礙中起重要而關(guān)鍵的作用，缺血時間愈長，腦間質(zhì)Glu與Asp的峰值濃度愈高，神經(jīng)病理學和神經(jīng)功能學損傷愈嚴重〔5，6〕。因此檢測IRI后腦組織Glu與Asp含量的變化，可從側(cè)面反映IRI的損傷程度，而降低興奮性氨基酸含量可能是改善IRI的一個有效治療手段。

離體及在體研究表明人參具有滋補、抗疲勞、益智、抗癌等多方面作用；GS是人參的主要藥理活性成分，研究表明其可通過調(diào)節(jié)細胞膜蛋白離子通道而發(fā)揮多種藥理效應〔1,7〕；Rg1是GS的一種單體及主要活性成分之一，作為小分子親脂性物質(zhì)而易于通過血腦屏障，其對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用及機制是目前研究的熱點〔8，9〕。已有研究表明GS Rg1可降低顱腦損傷大鼠神經(jīng)細胞的凋亡率達到腦保護作用〔10〕，通過抑制Bax表達，降低Bax/Bcl-2比值，從而減輕腦損傷；其效應可能與通過清除氧自由基，增加抗氧化反應而實現(xiàn)〔11〕；GS Rg1對海馬損傷大鼠的學習記憶同樣有促進作用，可能同樣與其抗氧化作用相關(guān)〔12〕。隨著年齡的增長，機體內(nèi)氧化應激水平逐漸升高，GS Rg1的抗氧化能力可減輕其對腦組織及血管造成的損傷，但其對腦IRI后是否存在保護作用及其機制，目前尚未明確。

本研究表明興奮性氨基酸參與了腦IRI和遲發(fā)性神經(jīng)損傷的發(fā)生發(fā)展。本研究還表明GS Rg1能改善老齡大鼠腦IR引起的腦組織功能損傷，其機制可能與其降低腦組織中Glu及Asp含量有關(guān)，從而減輕或限制了Glu、Asp等興奮性氨基酸的神經(jīng)興奮毒性。

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