李彥東 李 沫 蘇亞楠

(東北林業(yè)大學(xué)醫(yī)院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(AD)早期病理特征最主要的表現(xiàn)是細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積所導(dǎo)致的老年斑(SP)的形成和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)。雙股螺旋纖維(PHF)是NFTs的主要成分，異常磷酸化的tau蛋白則是導(dǎo)致PHF形成的最主要因素。AD患者神經(jīng)元變性時，大量的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)5被激活因子(p35、p39、p25等)所激活，激活的CDK5大量催化tau蛋白分子中連有脯氨酸的絲氨酸或蘇氨酸殘基的磷酸化，從而導(dǎo)致tau蛋白的磷酸化，最終促進(jìn)退行性病變的發(fā)生和發(fā)展。本實驗觀察人參皂苷Rg1對AD模型大鼠海馬的CDK5和磷酸化tau(p-tau)的表達(dá)影響，并探討其對AD模型大鼠的保護作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物和分組 健康SD大鼠60只，3月齡，體重250～300 g，購置于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，常規(guī)飼養(yǎng)。隨機分為青年組、模型組、人參皂苷Rg1小劑量組和人參皂苷Rg1大劑量組，每組15只。

1.2主要藥物和試劑 D-半乳糖溶液、Aβ1～40(上海江萊生物科技有限公司)；抗體CDK5和抗磷酸化p-tau(Ser404)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。人參皂苷Rg1，純度≥98%(上海純優(yōu)生物科技有限公司)。

1.3造模與用藥 D-半乳糖溶液50 mg/kg大鼠腹腔注射，連續(xù)注射6 w后施行海馬區(qū)注射〔1〕，每側(cè)注入Aβ1～40溶液1 μl。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素10萬U/d。造模成功后，人參皂苷RgH劑量組給予人參皂苷Rg1 20 mg·kg-1·d-1灌胃，人參皂苷Rg1大劑量組給予人參皂苷Rg1 40 mg·kg-1·d-1灌胃，青年組和模型組以等量生理鹽水灌胃，灌胃體積為20 ml/kg，1次/d，連續(xù)30 d。

1.4取材與檢測 造模成功的AD大鼠用藥30 d后，斷頭取雙側(cè)海馬，一側(cè)海馬制作石蠟切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SABC法)檢測CDK5和p-tau(Ser404)的表達(dá)情況，陽性表達(dá)為胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算陽性染色的平均光密度值。另一側(cè)海馬提取蛋白，利用Western印跡法檢測大鼠海馬CDK5和抗體p35的表達(dá)。使用Tanon GIS 4.0凝膠圖像分析軟件對條帶的光密度值進(jìn)行分析。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析LSD檢驗。

2 結(jié) 果

SABC染色結(jié)果和Western印跡結(jié)果均表明，海馬CA3區(qū)，與青年組比較，模型組CDK5和p-tau(Ser404)蛋白陽性染色均明顯增強(P<0.05)，表明模型組的CDK5激活量增加，活性增強；tau蛋白ser404位點磷酸化增多。與模型組比較，人參皂苷Rg1、小、大劑量組CDK5和p-tau(Ser404)蛋白陽性染色均明顯減弱(P<0.05)，表明這兩個治療組中CDK5激活量和活性均較模型組明顯降低；tau蛋白ser404位點磷酸化減弱。大劑量組與小劑量組比較，CDK5和p-tau(Ser404)蛋白陽性染色程度有所降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1、圖1和圖2)。

表1 各組海馬CA3區(qū)CDK5 與p-tau(Ser404)蛋白表達(dá)

A.青年組；B.模型組；C.人參皂苷Rg1小劑量組；D.人參皂苷Rg1大劑量組；下圖同

圖2 各組海馬區(qū)CDK5與p-tau(Ser404)蛋白表達(dá)(Western印跡)

3 討 論

tau蛋白是神經(jīng)細(xì)胞中含量最高的微管相關(guān)蛋白，對促進(jìn)微管的形成和維持微管穩(wěn)定性有著非常重要的作用〔2〕。在正常人腦中，tau蛋白的磷酸化水平相對比較低，但在AD時，過度磷酸化的tau蛋白失去了其生物學(xué)功能，并具有神經(jīng)毒性〔3〕。tau蛋白的異常過度磷酸化被認(rèn)為是AD致病的關(guān)鍵因素。tau蛋白過度磷酸化主要受到蛋白激酶活性與磷酸酯酶活性的調(diào)控，與脯氨酸介導(dǎo)的蛋白激酶(PDPK)關(guān)系較為密切的CDK5對tau的磷酸化起著非常重要的作用。

CDK5在神經(jīng)系統(tǒng)中的含量是最高的，是神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)元遷移、軸突運輸及多巴胺信號通路傳導(dǎo)等方面的重要調(diào)節(jié)因子〔4〕。CDK5單體無酶的活性，只有與其調(diào)節(jié)亞基p35或p39結(jié)合后才具有酶的活性，其中以p35的作用最為重要。在病理條件下，p35可經(jīng)中性鈣蛋白酶作用，水解為p25，p25要比p35穩(wěn)定，從而更大地發(fā)揮激活CDK5的作用。p35僅在腦中表達(dá)，所以CDK5是主要在神經(jīng)系統(tǒng)起作用的蛋白激酶。激活后的CDK5可催化在C端連有脯氨酸的絲氨酸或蘇氨酸殘基的磷酸化， Augustinack等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，AD病人的NFTs的神經(jīng)元中CDK5含量較正常對照組要高，同時，tau蛋白的磷酸化程度以及p25含量都相應(yīng)升高。許多tau蛋白分子中位點是脯氨酸指導(dǎo)的位點，主要有Ser199、Thr205、Ser396和Ser404等，因此能被CDK5有效地磷酸化。本實驗結(jié)果表明CDK5過表達(dá)時，可導(dǎo)致tau蛋白某些位點的磷酸化；CDK5活性受到抑制后，tau蛋白的某些位點的磷酸化程度就會降低，這與文獻(xiàn)報道〔5〕一致。陳娟等〔6〕報道，在利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立過度表達(dá)CDK-5的鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞株中，CDK5過度表達(dá)引起tau蛋白過度磷酸化，二者之間存在正相關(guān)關(guān)系。這些提示CDK5參與AD的早期NFTs形成的病理過程。

人參皂苷Rg1是人參中主要的生物活性成分，有抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腦損傷修復(fù)等作用。近年來，人參皂甙Rg1對神經(jīng)保護作用和治療神經(jīng)退行性疾病的受到關(guān)注〔7〕。謝玉華等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1具有與CDK5特異性抑制劑相似的作用，減輕Aβ25～35誘導(dǎo)的胎鼠海馬神經(jīng)元tau蛋白在Thr205、Ser396和Ser404位點的過度磷酸化程度。本實驗提示人參皂甙Rg1能通過抑制CDK5的活性來減弱tau蛋白的磷酸化程度，從而抑制或減緩AD模型大鼠的病理改變。人參皂苷Rg1對AD的作用機制的尚不十分明確，隨著對其治療神經(jīng)退行性疾病機制的研究不斷深入，可能會成為臨床治療AD的一種新藥。

4 參考文獻(xiàn)

1Paxinos G,Watson C. The rat brain in sterrotaxic coordinated (4nd)〔M〕.Australia:Academic Press Australia,1998:80-9.

2Dixit R,Ross JL,Goldman YE,etal.Differential regulation of dynein and kinesinmotor proteins by tau〔J〕.Science,2008;319(5866):1086-9.

3Mocanu MM,Nissen A,Eckermann K,etal. The potential for p-structure in the repeat domain of tau protein determines aggregation,synaptic decay,neuronal loss and coassembly with endogenous Tau in inducible mouse models of tauopathy〔J〕. J Neurosci,2008;28(3):737-48.

4Ko J,Humbet S,Bronson RT,etal.p35 and p39 are essential for cyclin-dependent kinase 5 function during neuro development〔J〕.J Neurosci,2001;21:6758.

5Augustinack JC,Sanders JL,Tsai LH,etal. Colocalization and fluorescence resonance energy transfer between CDK5 and AT8 suggests a close association in pre-neurofibrillary tangles and neurofibrillary tangles〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol,2002;61(6):557-64.

6陳 娟,李宏蓮,王建枝,等. CDK5過度表達(dá)對tau蛋白磷酸化的影響〔J〕.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2004;13(3):174-6.

7李 娜.人參皂苷Rg1治療神經(jīng)退行性疾病的研究進(jìn)展〔J〕. 中國老年學(xué)雜志,2012;32(15):3345-7.

8謝玉華,陳曉春,張 靜,等. 人參皂苷Rb1可能通過CDK5途徑減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的胎鼠海馬神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化〔J〕. 藥學(xué)學(xué)報,2007; 42(8): 828-32.