王敏娟 李亞軍 張 蓓 石少亭 郭長江 折 瀟 張世俊 左 星

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710077)

阿爾茨海默病(AD)病理變化之一是淀粉樣蛋白前體(APP)裂解成的β淀粉樣蛋白沉積腦內(nèi)所形成的老年斑及神經(jīng)元纖維纏結(jié)。AD的發(fā)病機制非常復(fù)雜，氧化應(yīng)激被認為是AD的一個重要致病因素，有研究表明，由異常沉積Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元代謝障礙和突觸功能喪失在AD發(fā)病中處于關(guān)鍵地位〔1，2〕。增強其抗氧化能力變成了近年來AD治療的一個靶點。腦內(nèi)主要的抗氧化含硒酶是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，GSH-Px通過活性中心的硒代半胱氨酸與氧代謝產(chǎn)物發(fā)生接觸反應(yīng)，發(fā)揮其抗氧化功能，研究表明硒能夠增強GSH-Px的抗氧化活性。本研究觀察亞硒酸鈉預(yù)處理對Aβ氧化損傷PC12細胞的影響。

1 材料與方法

1.1材料 PC12細胞株、亞硒酸鈉(購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實驗室)；Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)、Aβ1～40；二甲基亞砜(DMSO美國Sigma公司)。LDH、GSH-Px、丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；碘化丙啶(PI)、FITC-Annexin V(美國Sigma公司)；其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2主要儀器設(shè)備 Thermo Forma CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific)；POLARstar OPTIMA酶標儀(德國BMGLABTECH實驗儀器公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；超凈工作臺(天津泰斯特儀器有限公司)；流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) PC12細胞用含10%的小牛血清的DMEM培養(yǎng)基(100 mg/L鏈霉素，100 mg/L青霉素)在37℃、5%的CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液一次，5～6 d傳代一次。

1.3.2MTT法檢測亞硒酸鈉對PC12細胞活性的影響 選擇對數(shù)生長期的PC12細胞，胰酶消化后細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×105接種到96孔板上，待其貼壁后，在各組中加入亞硒酸鈉，使其終濃度為0、0.5、1、5、8、10、20、50、150 mg/L，總體積為200 μl，每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)44 h后，每孔內(nèi)加入MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h，然后吸去上清液，每孔內(nèi)加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，使紫藍色結(jié)晶充分溶解。用酶標儀490 nm波長檢測各孔吸光度(OD)值。

1.3.3分組 分為正常對照組、亞硒酸鈉預(yù)處理組、亞硒酸鈉預(yù)處理后損傷組、損傷組。正常對照組：PC12細胞培養(yǎng)72 h。亞硒酸鈉預(yù)處理組：PC12細胞加入含有亞硒酸鈉(終濃度0.5 mg/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。預(yù)處理后損傷組：PC12細胞加入含有亞硒酸鈉(終濃度0.5 mg/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，更換為含有Aβ的培養(yǎng)基(終濃度25 μmol/L)培養(yǎng)24 h。損傷組：PC12細胞培養(yǎng)48 h后加入含有Aβ的完全培養(yǎng)基(終濃度25 μmol/L)培養(yǎng)24 h。

1.3.4MTT法測定各組細胞的生存率 選擇對數(shù)生長期的PC12細胞，分組處理方法同上，用MTT法(同上)檢測各孔吸光度(OD)值。

1.3.5流式細胞儀檢測凋亡 選擇對數(shù)生長期的PC12細胞，分組處理方法同上，胰酶消化并收集各組細胞于10 ml離心管中，1000 r/min，離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用PBS再洗滌兩遍，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用100 μl的標記溶液(標記液：將FITC-Annexin V和PI加入到孵育緩沖液即10 mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2中，終濃度均為1 mg/L)重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min，1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20 min，避光并不時振動，做流式細胞儀分析。

1.3.6MDA含量測定 過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸結(jié)合，形成紅色產(chǎn)物，在532 mm處比色測定各管吸光度，通過公式計算可求出被測樣品中的MDA含量。測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.7GSH-Px活性及LDH漏出率測定 測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1亞硒酸鈉對PC12細胞的影響 當(dāng)亞硒酸鈉濃度為0.5 mg/L時，處理細胞24 h后，其OD值為0.80±0.11，與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(0.812 4±0.145 0，P>0.05)，隨著亞硒酸鈉濃度的增加(1，2，5，8，10，20，50 mg/L)，各組細胞的OD值也越來越小(0.775 0±0.176 5,0.720 0±0.239 4,0.483 3±0.306 2,0.330 0±0.258 2,0.261 7±0.174 0,0.210 0±0.143 8,0.131 7±0.098 0)，與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)濃度為150 mg/L時，細胞的OD值接近于零(0.108 3±0.204 0)。

2.2亞硒酸鈉對Aβ?lián)p傷PC12細胞的保護作用

2.2.1細胞形態(tài)學(xué)觀察 正常對照組PC12細胞的形態(tài)完整規(guī)則，細胞呈梭形有立體感；亞硒酸鈉預(yù)處理后的PC12細胞體積增大，形態(tài)豐滿，胞核大，胞質(zhì)豐富；Aβ?lián)p傷PC12細胞24 h后細胞的密度下降，融匯成片，細胞間空隙增大，形態(tài)有所改變，突起縮短甚至消失，大部分細胞呈球形，有活力細胞數(shù)目減少，胞質(zhì)較暗淡，貼壁細胞欠透明；亞硒酸鈉預(yù)處理后經(jīng)Aβ?lián)p傷的PC12細胞與損傷組比較，分布較均勻，未見匯聚成片，可見細胞突起，細胞形態(tài)較規(guī)則完整(圖1)。

正常對照組 亞硒酸鈉預(yù)處理組 損傷組 預(yù)處理后損傷組

2.2.2MTT結(jié)果 亞硒酸鈉預(yù)處理組細胞的OD值(1.04±0.09)較正常對照組(0.89±0.08)增高(P<0.05)，損傷組細胞的OD值(0.41±0.05)較正常對照組下降(P<0.01)，預(yù)處理后損傷組細胞的OD值(0.66±0.05)較損傷組增高(P<0.01)。

2.2.3流式細胞儀檢測凋亡 預(yù)處理后損傷組與損傷組相比，細胞的早期和晚期凋亡率均降低(P<0.05)。見表1。

2.3GSH-Px活性測定 損傷組GSH-Px活性較正常對照組下降(P<0.01)，亞硒酸鈉預(yù)處理組GSH-Px活性較正常對照組顯著增高(P<0.01)，而預(yù)處理后損傷組GSH-Px活性較損傷組增高(P<0.01)。各組細胞相比亞硒酸鈉預(yù)處理組GSH-Px活性最高，損傷組GSH-Px活性最低，預(yù)處理后損傷組GSH-Px活性較損傷組增高。見表2。

表1 亞硒酸鈉對Aβ氧化損傷PC12細胞凋亡率的影響

表2 亞硒酸鈉對Aβ氧化損傷PC12細胞各指標影響

2.4MDA含量、LDH漏出率測定 損傷組的MDA含量較正常對照組增高(P<0.01)，而預(yù)處理后損傷組較損傷組的MDA含量下降(P<0.05)。損傷組的LDH漏出率較正常對照組增高(P<0.01)，而預(yù)處理后損傷組較損傷組的LDH漏出率下降(P<0.01)。見表2。

3 討 論

AD臨床主要表現(xiàn)為進行性認知功能損害，精神行為癥狀和社會生活功能減退〔3〕。據(jù)統(tǒng)計，2006年，AD在全球的發(fā)病率就達到了2 655萬〔4〕，占了所有癡呆病例的50%～60%。本病最具特征性的病理改變?yōu)樯窠?jīng)細胞外老年斑和細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成。老年斑的主要成分是Aβ蛋白，Aβ蛋白在神經(jīng)細胞外積聚，通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等多種方式對神經(jīng)細胞造成損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞破裂而死亡。主要的損傷途徑如下：①Aβ聚集可以產(chǎn)生大量自由基，破壞細胞膜的完整性，干擾細胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)而誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡；②Aβ與特異性的受體相結(jié)合激活膠質(zhì)細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子等毒性物質(zhì)而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡；③Aβ產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物介導(dǎo)細胞損傷，抑制再生〔5，6〕。④Aβ與Cu2+、Zn2+等氧化型的金屬離子結(jié)合成復(fù)合物催化ROS生成。⑤AD早期Aβ即可進入線粒體與ABAD、CYPD等靶點結(jié)合誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞的凋亡〔7,8〕。有關(guān)動物實驗表明過度表達Aβ的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)與AD患者相似的氧化應(yīng)激損傷〔9〕，本研究使用Aβ作用于PC12細胞來模擬AD的體外發(fā)病模型，Aβ?lián)p傷組細胞的密度下降，部分細胞死亡，凋亡細胞增加，大部分細胞形態(tài)改變，LDH漏出率增加，同時該組細胞的抗氧化能力下降，表現(xiàn)為GSH-Px活性下降，并且脂質(zhì)過氧化物MDA的含量增加，這與AD的氧化應(yīng)激發(fā)病機制是一致的，即抗氧化能力減弱的同時自由基生成增加。此外，有研究表明AD患者的血清甲狀腺素水平顯著低于正常人群〔10〕，這可能也與氧化應(yīng)激有關(guān)。

大量證據(jù)顯示氧化應(yīng)激不僅是AD的早期事件,而且還激活特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起級聯(lián)酶促反應(yīng)〔1,11～15〕，它在AD的發(fā)病機制中處于關(guān)鍵的地位，因此針對抗氧化應(yīng)激的治療也受到極大關(guān)注。GSH-Px在機體的抗氧化防御體系中擔(dān)任重要角色，它與體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)一起構(gòu)成了機體的抗氧化防御體系。GSH-Px可以消除機體內(nèi)的過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物，阻斷活性氧自由基對機體的進一步損傷，是生物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除劑，它以Sec的形式發(fā)揮作用，以谷胱甘肽(GSH)為還原劑分解體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物，因而可防止細胞膜和其他生物組織免受過氧化損傷。GSH-Px是腦內(nèi)主要的抗氧化酶，活性中心Sec被氧化成為半胱次磺酸或二硫化物，后者再被硫氧還蛋白還原酶還原成半胱氨酸從而恢復(fù)GSH-Px的抗氧化活性。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可以使GSH-Px的Sec被氧化為亞磺酸甚至磺酸，該產(chǎn)物不能在硫氧還蛋白還原酶作用下還原為GSH-Px〔16〕，這意味著氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致了GSH-Px的數(shù)量減少、活性下降。因此維持GSH-Px在腦內(nèi)的含量和活性，在腦的抗氧化損傷中具有非常重要的意義。Aβ蛋白通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對神經(jīng)細胞造成損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞破裂而死亡，那么誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生更多的GSH-Px是否能夠改善AD的癡呆癥狀、延緩神經(jīng)功能的減退尚有待于進一步證實。目前，項長達5～12年P(guān)READVISE研究將揭示硒對AD的保護效應(yīng)。

本研究使用亞硒酸鈉預(yù)處理PC12細胞，發(fā)現(xiàn)低濃度的亞硒酸鈉可以促進細胞增殖，使細胞的存活率增加，細胞的突起延長，同時預(yù)處理組GSH-Px活性明顯增強，分析原因可能是一方面亞硒酸鈉通過強化神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子受體(IGFR)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等因子表達，促進細胞生長發(fā)育與分化，使細胞的存活率增加，同時亞硒酸鈉增強GSH-Px的表達最終提高了GSH-Px活性。經(jīng)過亞硒酸鈉預(yù)處理后的PC12細胞抵抗Aβ誘導(dǎo)的氧化損傷能力增強，與損傷組相比可見亞硒酸鈉預(yù)處理組細胞形態(tài)規(guī)則完整，分布較均勻，可見細胞突起；細胞的存活率增高；凋亡率、LDH漏出率、MDA含量下降；GSH-Px活性消耗減少。因此，本研究認為亞硒酸鈉可以誘導(dǎo)PC12細胞產(chǎn)生更多的GSH-Px，促進細胞增殖，增強細胞抵抗Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的能力，對改善AD的癡呆癥狀、延緩神經(jīng)功能的減退可能有一定的作用。

4 參考文獻

1Querfurth HW,Laferla FM. Alzheimer's disease 〔J〕. N Engl J Med,2010;362(4): 329-44.

2Butterfield DA,Reed T,Newman SF,etal. Roles of amyloid beta-peptide-associated oxidative stress and brain protein modifications in the pathogenesis of Alzheimer,s disease and mild cognitive impairment 〔J〕. Free Radic Biol Med,2007;43 (5): 658-77.

3Hiu MJ，Chen TF，Yip PK，etal.Behavioral and psychologic symptoms in different types of dementia.〔J〕. Formos Med Assoc，2006;105 (7):556-62.

4Brookmeyer R,Johnson E,Ziegler G,etal. Forecasting the global burden of Alzheimer's disease 〔J〕. Alzheimers Dement，2007;3(3):186-91.

5Guan ZZ.Cross-talk between oxidative stress and modifications of cholinergic and glutaminergic receptors in the pathogenesis of Alzheimer's disease〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2008;29(7):773-80.

6Zhu X，Smith MA，Honda K，etal.Vascular oxidative stress in Alzheimer disease 〔J〕.Neurol Sci，2007;257(1/2):240-6.

7Yan SD，Shi Y，Zhu A，etal.Role of ERAB/L-3- hydroxyacylcoenzyme A dehydrogenase type Ⅱ activity in A beta-induced cytotoxicity 〔J〕.Biol Chem，1999;274(4)：2145-56.

8Du H，Guo L，F(xiàn)ang F，etal.Cyclophilin D deficiency at tenuates mitochondfial and neuronal perturbation and a meliorates learning and memory in Alzheimer's disease 〔J〕.Nat Med，2011;14(10)：1097-105.

9Barde YA，Edgar D，Thoenen H.Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain 〔J〕.EMBO J，1982;1(5):549-53.

10方凌燕，劉衍宇，關(guān)俊文.阿爾茨海默病與生物節(jié)律相互關(guān)系的研究進展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011；31(4)：1486-8.

11Petersen RB,Nunomura A,Lee HG,etal. Signal transduction cascades associated with oxidative stress in Alzheimer’s disease 〔J〕. Alzheimers Dis,2010;11 (2): 143-52.

12Su B,Wang X,Nunomura A,etal. Oxidative stress signa-ling in Alzheimer’s disease 〔J〕. Curr Alzheimer Res,2008;5(6): 525-32.

13Durackova Z. Some current insights into oxidative stress 〔J〕. Physiol Res,2009;12 (1): 1-30.

14Su B,Wang X,Lee HG,etal. Chronic oxidative stress causes increased tau phosphorylation in M17 neuroblastoma cells 〔J〕.Neurosci Lett,2010;468 (3): 267-71.

15Cenini G,Sultana R,Memo M,etal. Effects of oxidative and nitrosative stress in brain on p53 proapoptotic protein in amnestic mild cognitive impairment and Alzheimer disease 〔J〕. Free Radic Biol Med,2011;45 (1): 81-5.

16Chevallet M,Wagner E,Luche S,etal.Regeneration of peroxiredoxins during recovery after oxidative stress 〔J〕. Biol Chem，2003;278(39):37146-53.