陳昌喆 段 磊 王 賢 吳宗貴

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200003)

多種因素參與缺血所致心肌細胞損傷，如氧化應(yīng)激、鈣超載、血管內(nèi)皮細胞功能紊亂、細胞凋亡、能量代謝障礙等〔1,2〕。瓜蔞為葫蘆科植物瓜蔞的干燥成熟果實，為常用中藥材，其果皮即瓜蔞皮含有多種生物活性物質(zhì)，如含棕櫚酸等少量揮發(fā)油類、19種游離氨基酸和豐富的礦物質(zhì)元素及甾醇、黃酮類、三萜類和栝樓酯堿〔3〕等。瓜蔞皮有縮小冠脈結(jié)扎大鼠心肌梗死面積、抗氧化應(yīng)激、抗動脈粥樣硬化等作用〔4〕。本研究擬觀察瓜蔞皮提取液(PTE)對大鼠缺血心肌損傷的拮抗作用并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康Wistar大鼠40只，體重(230±20)g，雌雄不限，由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分成正常對照組、心肌缺血(MI)組(模型組)、單硝酸異山梨酯片(IMT)組和瓜蔞皮提取液(PTE)組各10只。

1.2藥品與試劑 購市售瓜蔞皮1 000 g，加水浸泡0.5 h后，文火煎煮沸騰后繼續(xù)煎煮20 min，倒出汁液，再加水同法煎煮1次，合并兩次所得汁液，蒸發(fā)至1 000 ml(相當(dāng)于生藥1.0 g/ml)備用；IMT(20 mg，山東魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn));鹽酸異丙腎上腺素注射液(1 mg/2 ml,上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn))；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和內(nèi)源性一氧化氮合酶(iNOS)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)；兔抗鼠內(nèi)皮素(ET)、Bcl-2、Bax多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司提供)，羊抗兔多克隆二抗由北京中杉生物試劑公司提供，DAB購自sigma公司。

1.3動物模型的復(fù)制 正常對照組與MI組按1 ml·100 g-1·d-1體重生理鹽水灌胃；IMT組給藥劑量按0.125 mg·kg-1·d-1體重，灌胃藥液容積為0.1 ml·kg-1·d-1；PTE組按3.0 g·kg-1·d-1給藥，按事先所制備好的藥液濃度1.0 g/ml，計算出應(yīng)該灌胃藥液容積給予灌胃。連續(xù)灌胃15 d。從第13天起，每日于灌胃結(jié)束后1 h，正常對照組皮下多點注射生理鹽水0.2 ml/kg，其余3組分別給予鹽酸異丙腎上腺素(Iso)0.1 mg/kg多點皮下注射，連續(xù)注射3 d，觀察記錄首次注射Iso前10 min和末次注射30 min后標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)碾妶D。以心電圖出現(xiàn)J點移位(升高或降低≥0.1 mV)或T波改變(高聳、雙相或倒置)或出現(xiàn)Q波,作為判定動物模型復(fù)制成功的標(biāo)志〔5〕。

1.4血清指標(biāo)檢測 心電圖記錄2 h后，取股部動靜脈混合血3～5 ml,離心，取血清，全自動生化分析儀檢測血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)活性；按試劑盒說明檢測血清SOD、iNOS活性及MDA含量。

1.5心肌組織內(nèi)Bcl-2、Bax、ET表達檢測 取血后迅速打開胸腔，摘取心臟，用冰生理鹽水迅速洗凈血液，濾紙吸干水分，取大鼠心臟中下1/3處的部分心肌，用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，免疫組化法檢測心肌組織內(nèi)Bcl-2、Bax和ET的表達情況。以心肌細胞胞漿及核膜出現(xiàn)棕黃色為陽性,每張切片隨機選取10個完整而不重疊的400×高倍鏡視野進行灰度掃描，測定每個視野下陽性反應(yīng)的光密度(OD)值。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行方差分析和LSD法檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組心電圖陽性變化 MI組標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)碾妶D均出現(xiàn)J點移位(升高或降低≥0.1 mV)， T波高聳、雙相或倒置或Q波，心電圖陽性變化動物數(shù)與正常對照組有顯著差異(P<0.01)；PTE組陽性變化動物數(shù)(n=2)顯著低于MI組(P<0.05)。PTE組與IMT組(n=3)無顯著差異。

2.2各組血清心肌酶檢測結(jié)果 與正常對照組比較，MI組血清AST、LDH、CK值明顯升高(P<0.01)； IMT組及PTE組血清AST、LDH、CK值與MI組比較均明顯降低 (P<0.05,P<0.01)；PTE組血清心肌酶變化與IMT組無顯著差異，見表1。

表1 各組血清心肌酶水平比較

2.3各組血清SOD、MDA和iNOS檢測結(jié)果 與正常對照組比較，MI組血清MDA及iNOS值明顯升高(P<0.01)，而SOD值明顯降低(P<0.05)；IMT組及PTE組血清MDA、iNOS值均明顯低于MI組(P<0.05)，SOD值明均顯高于MI組(P<0.05)；PTE組血清SOD、MDA及iNOS變化與IMT組無顯著差異，見表2。

表2 3組血清SOD、MDA和iNOS水平比較

2.4各組心肌組織內(nèi)Bcl-2、Bax及ET表達檢測結(jié)果 與正常對照組相比，MI組心肌組織中陽性表達Bcl-2、Bax蛋白及ET心肌細胞明顯增多，陽性染色的胞質(zhì)增加(均P<0.05)。與MI組比較，PTE組Bcl-2蛋白呈陽性表達的心肌細胞數(shù)及陽性染色的胞質(zhì)均增加，而Bax蛋白、ET表達則明顯減少(P<0.05);IMT組Bcl-2、Bax蛋白及ET表達與PTE組無顯著差異。見表3,圖1，圖2。

表3 各組心肌組織Bcl-2、Bax及ET表達比較

圖1 各組Bcl-2在心肌的表達(ABC，×400)

Bax

ET

3 討 論

氧化應(yīng)激參與缺血所致細胞損傷〔6〕。缺血時產(chǎn)生的活性氧會因膜脂質(zhì)過氧化而使細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體等結(jié)構(gòu)的生物膜流動性降低而通透性增加，細胞器結(jié)構(gòu)破壞及功能受損。MDA為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可間接反映氧化應(yīng)激水平；SOD為內(nèi)源性自由基清除劑，具有抗氧化應(yīng)激作用。活性氧還具有使蛋白質(zhì)功能喪失及核酸、染色體破壞等作用。NO作為體內(nèi)重要的信號分子及氣體自由基具有保護和損傷雙相作用，生理濃度NO具有舒張血管、抑制白細胞計數(shù)(WBC)、血小板黏附及血小板聚集等作用，而高濃度的NO在氧化應(yīng)激條件下可與超氧陰離子反應(yīng)后生成ONOO-，其在偏酸條件下極易自發(fā)分解生成羥自由基而產(chǎn)生組織損傷效應(yīng)。NO有三種亞型，其中的iNOS可在內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6等刺激下產(chǎn)生大量NO并對組織細胞造成損傷〔7〕。

本研究結(jié)果表明， PTE對缺血心肌的保護作用是通過降低iNOS活性使NO合成減少，減少自由基生成；提高SOD活性以清除自由基；抑制自由基所致的膜脂質(zhì)過氧化作用，減輕了缺血所致心肌細胞損傷而實現(xiàn)的。

血管內(nèi)皮功能紊亂也是缺血性心肌損傷機制之一。缺血缺氧時可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，并介導(dǎo)中性粒細胞黏附、貼壁滾動、激活并釋放炎癥介質(zhì)而損傷血管內(nèi)皮細胞(VEC)，進而使VEC對NO、前列環(huán)素等擴血管物質(zhì)合成減少，而ET、血管緊張素(Ang)Ⅱ、血栓素A2等縮血管物質(zhì)釋放增多，以致微血管舒縮功能失調(diào)〔2〕。本研究結(jié)果說明心肌缺血時因內(nèi)皮功能紊亂使ET釋放增加而引起冠狀動脈痙攣、加重心肌缺血性損傷。而PTE可下調(diào)ET在心肌中表達，提示PTE可抑制ET釋放，解除冠脈痙攣，改善心肌供血，保護心肌細胞。

細胞凋亡也參與缺血所致心肌細胞損傷。缺血所致供氧不足可使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體因內(nèi)環(huán)境失衡而腫脹、破裂，細胞色素C釋放入胞質(zhì)并激活caspase級聯(lián)反應(yīng)而引起細胞凋亡〔8〕。Bcl-2為凋亡抑制基因，Bax為促凋亡基因，而Bcl-2基因表達產(chǎn)物可通過抗氧化、抑制線粒體細胞色素C釋放、抑制Bax等作用抑制細胞凋亡〔1〕。本研究結(jié)果提示PTE可通過抑制心肌細胞凋亡而對缺血心肌起到一定的保護作用。瓜蔞皮的有效成分及其具體抗心肌缺血機制有待深入研究。

4 參考文獻

1Stanely M,Prince P, Roy AJ. p-Coumaric acid attenuates apoptosis in isoproterenol-induced myocardial infarcted rats by inhibiting oxidative stress〔J〕. Int J Cardiol，2013;168(4):3259-66.

2Verma S, Buchanan MR, Anderson TJ. Endothelial function testing as a biomarker of vascular disease〔J〕. Circulation,2003;108(17):2054-9.

3劉金娜, 溫春秀,劉 銘,等.瓜蔞的化學(xué)成分和藥理活性研究進展〔J〕.中藥材，2013;36(5):843-8.

4孫 娟,趙啟韜,黃臻輝,等. 瓜蔞皮對急性心肌缺血大鼠的保護作用〔J〕. 中藥藥理與臨床,2013;29(3):114-6.

5王秋紅,匡海學(xué),吳 倫,等.二氫槲皮素對異丙腎上腺素致大鼠心肌缺血的保護作用〔J〕. 中國實驗方劑學(xué)雜志,2011;17(17):177-80.

6Elahi MM, Kong YX, Matata BM. Oxidative stress as a mediator of cardiovascular disease〔J〕. Oxid Med Cell Long,2009;2(5): 259-69.

7F?rstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: regulation and function〔J〕. Eur Heart J，2012;33(7):829-37.

8潘奇正,張 蕾,吳金義.線粒體氧化應(yīng)激在心肌缺血性損傷中的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2011;31(16):3119-21.