劉 軍 肖 軍 張山鋒 毛 唯 楊鐘華

(武漢市普愛醫(yī)院骨外科，湖北 武漢 430030)

多發(fā)性骨髓瘤是終末分化的漿細胞異常克隆性增生的惡性血液系統(tǒng)腫瘤，是一種低凋亡活性的分子克隆性疾病，伴隨著對癌基因激活和抑癌基因失活的深入, 基因治療被引入腫瘤治療的方法中。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，p73基因在健康人骨髓中低表達，而在骨髓瘤患者中高表達，在輕鏈型骨髓瘤表達明顯高于在其他亞型骨髓瘤中的表達，而且p73基因的表達與骨髓瘤的分期呈正相關(guān)〔1〕。本研究通過siRNA干擾技術(shù)抑制骨髓瘤細胞系U2OS中p53基因的表達，在削弱p53表達的遺傳背景下，觀察TAp73和DNp73對順鉑誘導(dǎo)的U2OS細胞株增殖抑制和細胞凋亡的影響，并初步探討相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和細胞株 人骨髓瘤細胞株U2OS購買于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。胎牛血清、MEM培養(yǎng)基均為美國Gibco公司產(chǎn)品。順鉑(P4394)購自美國Sigma公司。p53基因siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。RIPA蛋白裂解液(強型)和ECL化學(xué)發(fā)光液均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。β-actin、TAp73、DNp73、Bax和Bcl-2抗體購自美國Bioworld Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000購自美國Invitrogen公司。四甲基氮唑藍(MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司。羊抗鼠和羊抗兔二抗均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) U2OS細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化傳代后置含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2天傳代1次。

1.2.2p53 siRNA轉(zhuǎn)染U2OS細胞 由上海吉瑪制藥設(shè)計并合成特異性針對p53基因mRNA的siRNA序列和陰性對照siRNA序列。p53 siRNA正義鏈：5′-CCCGGACGAUAUUGAACAATT-3′；反義鏈：5′-UUGUUCAAUAUCGUCCGGGTT-3′。陰性對照siRNA正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACG-3′； 反義鏈：5′- ACGUGACACGUUCGGAGA-3′。選處于對數(shù)生長期的U2OS細胞制備單細胞懸液(2.0×105/ml) 接種在12孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml細胞懸液，待細胞貼壁后，參照Lipo2000轉(zhuǎn)染說明進行RNA轉(zhuǎn)染操作，設(shè)3個實驗組：空白對照組(未經(jīng)RNA干擾處理的U2OS細胞)；p53 siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染p21 siRNA的U2OS細胞)；陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的U2OS細胞)，轉(zhuǎn)染6 h更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育18 h后收集細胞。Western 印跡方法驗證轉(zhuǎn)染效率(方法見1.2.5)。

1.2.3MTT試驗 選處于對數(shù)生長期的U2OS細胞制備單細胞懸液，以每孔5.0×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板24 h后。分別加入終濃度為0(溶劑對照)、5、10、20和40 μmol/L的順鉑處理細胞24 h。移去含有順鉑的細胞培養(yǎng)液，PBS液緩沖液清洗2次，每孔加入100 μl MTT 溶液(終濃度為0.05 mg/ml)，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)溶液，在搖床輕輕振蕩10 min溶解結(jié)晶后，采用Synergy 2 型多功能酶標儀在570 nm處測定光密度(OD)值，并計算細胞生長率(細胞生長率=OD順鉑組/OD對照組×100%)。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法分析細胞凋亡情況 將處于對數(shù)生長期的U2OS細胞調(diào)整成細胞濃度為2.5×104/ml 后，接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，按前述方法順鉑處理24 h后，PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心10 min收獲細胞，并制備成濃度為5.0×106/ml單細胞懸液，取100 μl細胞懸液，加入400 μl 上樣緩沖液重懸細胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI混勻，常溫避光孵育20 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡變化情況。

1.2.5Western 印跡法測定TAp73、DNp73、Bax和Bcl-2蛋白表達水平 將處于對數(shù)生長期的U2OS細胞調(diào)整成細胞濃度為2.5×104/ml 后，接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，按前述方法順鉑處理24 h。移去含順鉑的細胞培養(yǎng)液，用4℃預(yù)冷PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心10 min收獲細胞于1.5 ml的Ep管中，每管加入25 μl細胞裂解液冰上裂解30 min，以14 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA 法進行蛋白質(zhì)定量。取等量的待測蛋白樣品與5×SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻，95℃變性5 min。在10%SDS-聚丙烯酰胺中凝膠電泳2 h，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜(孔徑為0.45 μm)。用含5%脫脂奶粉的封閉緩沖液(tris-buffered saline Tween-20，TBST)37℃孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加一抗4℃過夜(稀釋倍數(shù)為1∶400)。次日，TBST洗膜3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(稀釋倍數(shù)均為1∶2 500)在37 ℃孵育1 h。TBST洗膜3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液，采用熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)檢測蛋白表達，并通過系統(tǒng)自帶軟件分析各組蛋白條帶的灰度值進行比較。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1p53siRNA對U2OS細胞中p53蛋白表達的影響 p53 siRNA干擾組p53蛋白表達水平顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)；而陰性對照組與空白對照組p53蛋白表達水平比較則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

1.空白對照組；2.陰性對照組；3.siRNA干擾組

2.2細胞活力檢測結(jié)果 隨著處理濃度的增加，5、10、20、40 μmol/L U2OS細胞活力隨之降低(0.897±0.057、0.825±0.073 9、0.784±0.047 8、0.713±0.062 1)，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，且與空白對照組差異(P<0.01)。

2.3細胞凋亡分析結(jié)果 隨著處理濃度的增加，5、10、20、40 μmol/L U2OS細胞凋亡率隨之增加(7.833±2.071、16.795±4.388、10.054±2.977、27.882±5.217)呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，且與空白對照相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4Western 印跡法結(jié)果 隨著處理濃度的增加，U2OS細胞中TAp73、DNp73和Bax蛋白表達量明顯增加，與空白對照組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見圖2。而各濃度順鉑處理組的Bcl-2蛋白表達量與空白對照組相比無明顯變化(P>0.05)。隨著順鉑處理濃度的增加，TAp73/DNp73和Bax/Bcl-2也明顯升高，與溶劑對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。隨著不同濃度順鉑處理U2OS細胞24 h，細胞內(nèi)TAp73與DNp73蛋白相對表達水平比值TAp73/DNp73大體上呈劑量依賴性升高；當(dāng)濃度>5 μmol/L時有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)濃度>10 μmol/L時具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨著不同濃度順鉑處理U2OS細胞24 h，細胞內(nèi)Bax/Bcl-2蛋白相對表達水平呈劑量依賴性性升高；當(dāng)濃度>5 μmol/L時有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)濃度>10 μmol/L時具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各濃度U2OS組各蛋白表達

圖2 不同濃度順鉑處理U2OS細胞24 h時TAp73、DNp73、Bax和Bcl-2蛋白水平變化

3 討 論

p73基因與經(jīng)典的抑瘤基因p53高度同源，由于其存在兩類功能相反的異構(gòu)體，使調(diào)控功能遠比p53復(fù)雜。TAp73異構(gòu)體中的p73α或p73β過度表達時可激活p53靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起細胞凋亡〔2,3〕。Zhu等〔4〕研究顯示，p73α能增強由化療藥物誘導(dǎo)的MCF-7細胞株的凋亡，能與順鉑等DNA損傷劑共同誘導(dǎo)p53靶基因的表達，能以依賴p53基因的途徑聯(lián)合DNA損傷劑增強細胞的凋亡效應(yīng)〔5〕。何勇等〔5〕等利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將野生型p73α基因?qū)雙53基因純合缺失的人肺腺癌細胞株H1299，發(fā)現(xiàn)p73α的表達上調(diào)，可以使肺腺癌細胞對DNA損傷劑化療藥物的敏感性顯著升高。這表明化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡包括p53依賴和非p53依賴兩條途徑。與TAp73相反，DNp73轉(zhuǎn)錄激活區(qū)缺失，無法激活p53和TAp73靶基因的轉(zhuǎn)錄，但卻發(fā)現(xiàn)其在多數(shù)腫瘤組織中呈現(xiàn)出高表達，如乳腺癌、神經(jīng)母細胞瘤、卵巢癌、胃癌、胰腺癌和肺癌等〔6,7〕；另外，有研究發(fā)現(xiàn)，裸鼠一旦接種轉(zhuǎn)染了DNp73的NIH3T3細胞，將很快形成腫瘤〔8〕。Pozniak等〔9〕研究證實，在全長TAp73異構(gòu)體占優(yōu)勢的細胞中，p73可協(xié)同p53來誘導(dǎo)細胞凋亡；而在DNp73異構(gòu)體占優(yōu)勢的細胞中，p73則削弱p53誘導(dǎo)的細胞凋亡效應(yīng)。因此，在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及腫瘤耐藥的過程中，p73不同異構(gòu)體表達模式(TAp73/DNp73表達比)的變化比單純某一亞型表達水平的改變更有意義。

MTT和細胞凋亡結(jié)果提示在本實驗體系中，順鉑處理激活了p53非依賴性細胞凋亡信號通路。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在各順鉑處理組中，TAp73和DNp73的表達量均明顯上調(diào)，但前者上升趨勢更強，使得TAp73/DNp73的比值隨著順鉑濃度的增加而顯著升高；同時，p53(或TAp73)依賴性的線粒體促凋亡蛋白Bax的表達量明顯升高，而其拮抗蛋白Bcl-2的表達變化不顯著，因此，Bax/Bcl-2的比值隨著順鉑處理濃度的增加而顯著升高，使得細胞向有利于凋亡的方向發(fā)展。本實驗?zāi)Ｐ驼f明，順鉑處理首先激活了TAp73的表達，激活的TAp73分別上調(diào)了DNp73和Bax的表達，進而使得TAp73/DNp73和Bax/Bcl-2兩個比值升高，細胞走向凋亡。

綜上所述，TAp73/DNp73比值的變化可顯著提高U2OS-p53對于化療藥物順鉑的敏感性。由此，在骨髓瘤的臨床診療過程中，針對化療藥物耐藥的腫瘤病例，p73基因不同異構(gòu)體表達模式將有可能作為一個重要的基因治療靶點，增強腫瘤的藥物敏感性。

4 參考文獻

1徐聰琴，鄭翠萍，謝軍軍，等. P73基因在骨髓瘤的表達及臨床意義〔J〕. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011；21(10):2458-60.

2Jost CA,Marin MC，Kaelin WG.p73 is a simian[correction of human]p53-related protein that can induce apoptosis 〔J〕. Nature,1997;389 (6647):191-4.

3Ramadan S,Terrinoni A,Catani MV,etal.Candi p73 induces apoptosis by different mechanisms 〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2005;331 (3): 713-7.

4Zhu J, Nozell S, Wang J,etal.p73 cooperates with DNA damage agents to induce apoptosis in MCF7 cells in a p53-dependent manner 〔J〕. Oncogene,2001;20 (30): 4050-7.

5何 勇，范士志，蔣耀光，等.p73基因?qū)θ朔蜗侔┘毎鸋1299化療敏感性的影響〔J〕. 癌癥,2004;23(6):645-9.

6Bantel H,Simon HU.DeltaNp73beta is oncogenic in hepatocellular carcinoma by blocking apoptosis signaling via death receptors and mitochondria 〔J〕. Cell Cycle,2010;9(14):2710-1.

7Uramoto H,Sugio K,Oyama T,etal.Expression of deltaNp73 predicts poor prognosis in lung cancer 〔J〕. Clin Cancer Res,2004;10(20):6905-11.

8Stiewe T,Zimmermann S,Frilling A,etal.Transactivation-deficient DeltaTA-p73 acts as an oncogene 〔J〕. Cancer Res, 2002; 62 (13): 3598-602.

9Pozniak CD,Radinovic S,Yang A,etal.An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death 〔J〕. Science,2000;289(5477):304-6.