張林會(huì) 李勝超 孫國(guó)柱

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 石家莊 050000)

顱腦損傷包括機(jī)械性沖擊造成的原發(fā)性損傷和損傷后啟動(dòng)的一系列生化過程引起的繼發(fā)性、進(jìn)行性神經(jīng)細(xì)胞損傷即繼發(fā)性腦損傷，前者具有不可預(yù)料性和難控制性，后者則是在首次損傷后啟動(dòng)的包括一系列神經(jīng)生化降解過程的損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔1〕，炎性細(xì)胞因子大量激活并分泌，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，與顱腦損傷的過程及其預(yù)后密切相關(guān)〔2〕，但有關(guān)炎性細(xì)胞因子表達(dá)規(guī)律的報(bào)道較少。為此，本研究通過制作液壓打擊顱腦損傷模型，觀察腦組織含水量、組織學(xué)變化以及炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、ICAM-1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，探討炎性細(xì)胞因子在繼發(fā)腦損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 成年雄性SD大鼠48只，體重250～300 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，兔抗鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1多克隆抗體購(gòu)于Sigma公司，兔二步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Santa Cruz公司，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2動(dòng)物分組和模型制作 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2組，其中模型組40只，再按照傷后1、6、12、24 h、3、7 d又分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只；假手術(shù)組共8只。采用Dixon法制作動(dòng)物模型〔3〕。假手術(shù)組，僅切開頭皮，鑿骨窗，不行液壓打擊，余同上。喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用純凈水，使用動(dòng)物專用籠箱和潔凈墊料，恒溫20～25℃飼養(yǎng)。自由進(jìn)食水。

1.3標(biāo)本的制作和采集 假手術(shù)組在術(shù)后，模型各亞組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，在氯胺酮過度麻醉下，4%多聚甲醛經(jīng)心灌注,開顱取腦，以經(jīng)過挫傷灶的橫線為基線，在基線前側(cè)取(200±50) mg腦組織用于測(cè)定腦組織含水量，取挫傷灶后(斷面跨挫傷灶)約4 mm厚的腦組織進(jìn)行固定和石蠟包埋，獲得的組織切片行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.4干濕法測(cè)定腦組織含水量 所取標(biāo)本先用濾紙吸除表面水分，置電子分析天平(分度值0.000 1 g)稱取濕重(W)，再經(jīng)110 ℃ 恒溫烤箱烘烤24 h后稱取干重(D)。應(yīng)用公式：腦組織含水量(%)=(W-D)/ W ×100，計(jì)算出腦組織含水量。

1.5免疫組化觀察AQP4表達(dá) 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化染色試劑盒進(jìn)行染色。陰性對(duì)照分別用正常山羊血清和PBS代替IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1一抗作孵育，其余步驟同上。以細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色粗顆?；蜃攸S色細(xì)膩顆粒為陽性結(jié)果。采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以細(xì)胞平均光密度值(OD)表示IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1陽性表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件單因素方差分析，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1腦組織含水量 與假手術(shù)組(78.46±1.112)%比較，模型組1 h(77.94±0.762)%時(shí)無差異(P>0.05)，6 h時(shí)稍升高(79.11±1.276)%，12 h顯著升高(80.26±1.473)%，24 h至3 d達(dá)到高峰(82.74%±1.097%,82.04%±1.694%)，7 d時(shí)降低(80.72±1.866)%。

2.2IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1表達(dá) IL-1β表達(dá)：與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物水腫腦組織的IL-1β表達(dá)6～12 h升高(P<0.05)，24 h至3 d達(dá)到高峰，至3 d開始下降，至7 d仍高于SO組。IL-6表達(dá)：與SO組相比，TBI組動(dòng)物水腫腦組織的IL-6蛋白表達(dá)自傷后1 h開始升高，12 h持續(xù)增加，在傷后24 h到達(dá)高峰，傷后3 d至7 d后逐漸降低。TNF-α表達(dá)：TBI組動(dòng)物水腫腦組織TNF-α表達(dá)從1h開始增高，6 h至12 h達(dá)到高峰，24 h 后逐漸下降，仍高于SO組。ICAM-1表達(dá)：與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物水腫腦組織ICAM-1表達(dá)自傷后6 h開始升高，傷后12 h仍繼續(xù)上升，24 h達(dá)高峰，3 d開始逐漸減低，7 d后仍高于SO組(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1的表達(dá)變化

圖1 模型組各炎性因子表達(dá)(DAB，×400)

2.3組織學(xué)觀察 模型組大鼠傷后1 h可見挫裂傷灶結(jié)構(gòu)破壞，點(diǎn)片狀出血，膠質(zhì)細(xì)胞胞漿有空泡樣變。6 h挫裂傷灶組織崩解，其周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞變形及出現(xiàn)空泡樣變性，血管外間隙擴(kuò)大。12 h神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞空泡樣繼續(xù)增加。24 h膠質(zhì)細(xì)胞胞漿空泡樣變更加明顯，數(shù)量增加；神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹，胞質(zhì)嗜酸性變，胞核固縮變形，偏心，且神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞周圍水腫，間隙變寬。3 d大量神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，膠質(zhì)細(xì)胞顯著增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。7 d壞死空洞由纖維組織填充，膠質(zhì)細(xì)胞增生更加明顯，水腫有所減輕，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)。假手術(shù)組動(dòng)物光鏡下見腦組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列有序，無損傷、水腫及出血，神經(jīng)細(xì)胞類圓形，核仁藍(lán)色淡染，核膜完整。

2.4IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1表達(dá)和腦水腫的關(guān)系 線性回歸分析顯示：水腫腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1的表達(dá)與腦含水量之間呈正相關(guān)(r=0.805，r=0.763，r=0.927，r=0.866，均P<0.05)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)說明炎性因子參與了繼發(fā)性腦損傷的病理發(fā)生發(fā)展過程。正常腦組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)輕微，但是創(chuàng)傷性顱腦損傷發(fā)生后，由于受到機(jī)械性創(chuàng)傷以及合并缺血、缺氧等病理因素的作用下，腦組織產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，破壞血腦屏障，引起腦水腫，加劇繼發(fā)性損傷〔4,5〕。TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1被認(rèn)為屬于促炎細(xì)胞因子，它們?cè)陲B腦損傷后以及腦水腫的早期短暫超量表達(dá)是造成繼發(fā)性顱腦損害的重要因素，甚至認(rèn)為其表達(dá)水平可作為衡量顱腦損傷后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)程度的重要指標(biāo)〔6～8〕。

TNF-α是損傷后較早期釋放的促炎細(xì)胞因子，具有多種生物效應(yīng)，可以激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素和次級(jí)炎癥介質(zhì)的合成〔9〕，高表達(dá)時(shí)會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡〔10〕。IL-1β其過量表達(dá)一方面，通過滲透進(jìn)入血管外組織中，活化的白細(xì)胞釋放大量的氧自由基和蛋白水解酶，損傷腦組織; 另一方面，白細(xì)胞的牢固黏附導(dǎo)致微血管阻塞，腦組織缺血缺氧，從而加重腦組織的損傷。其細(xì)胞因子IL-1β mRNA的表達(dá)與炎癥程度呈正相關(guān)〔11〕。

IL-6作為一種重要的炎性介質(zhì)，在腦損傷中對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響是雙向的。一方面在腦損傷的腦組織中顯著增高，能促使白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加血腦屏障的通透性，并產(chǎn)生氧自由基，引起神經(jīng)細(xì)胞死亡，參與繼發(fā)性腦損傷的過程〔12〕，另一方面，IL-6也是一種具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用的因子。ICAM-1表達(dá)于血管內(nèi)皮和白細(xì)胞表面，能夠調(diào)節(jié)白細(xì)胞的滲透、遷移，對(duì)中性粒細(xì)胞具有募集作用。研究發(fā)現(xiàn)腦脊液中可溶性ICAM-1濃度與CT顯示腦創(chuàng)傷范圍呈正相關(guān)性，其變化水平反映顱腦損傷程度，應(yīng)用ICAM-1抗體或?qū)CAM-1基因剔除可降低腦卒中鼠模型淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、減輕腦組織水腫及神經(jīng)損傷程度，提高存活率〔13〕。

總之，損傷腦組織中 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α均出現(xiàn)高表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)可能有助于減輕繼發(fā)性腦損傷，改善預(yù)后。

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