葉麗平 馬靜方 楊春雨 仇會會

(遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

卵巢癌是人體病理類型最多最復(fù)雜的惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展與腫瘤的增殖及凋亡的失控有著密切關(guān)系。研究表明，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)激活的多種信號通路與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)且bFGF可以顯著地促進(jìn)卵巢癌的增殖，侵入和血管的發(fā)生，但其具體發(fā)生機制仍不明確。前期試驗表明，在卵巢癌中，bFGF可抑制無血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;促進(jìn)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)及Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)增加。本實驗探討CREB、bFGF和Bcl-2蛋白與卵巢惡性上皮性腫瘤發(fā)生的關(guān)系表達(dá)。

1 資料與方法

1.1病例資料和組織標(biāo)本 收集2004年1月至2011年6月遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科卵巢癌手術(shù)切除標(biāo)本120例，患者年齡31～84歲。其中卵巢惡性上皮性腫瘤82例(漿液性囊腺癌26例，黏液性囊腺癌24例，子宮內(nèi)膜樣囊腺癌 32例)；卵巢良性腫瘤組織20例，卵巢正常組織18例。所有患者術(shù)前均未接受放、化學(xué)或免疫治療，且均具有完整臨床資料。所有標(biāo)本均經(jīng)我院病理科確診。

1.2標(biāo)本的處理 組織標(biāo)本均用磷酸緩沖液配置的 10%中性甲醛固定液及時固后,進(jìn)行乙醇梯度脫水，二甲苯透明以及石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.3免疫組織化學(xué)實驗 (1)兔抗人bFGF多克隆抗體購自福建邁新工作液，兔抗人CREB多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人Bcl-2購自北京中杉工作液， SP超敏試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司 按試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色，每次試驗均設(shè)陰性對照，用磷酸鹽(PBS)緩沖液代替一抗作為陰性對照，以公司提供的陽性片染色作為陽性對照。(2)實驗結(jié)果判斷：細(xì)胞內(nèi)呈棕黃色顆粒狀為陽性表達(dá)，其中bFGF陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，CREB陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，Bcl-2陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)。評分方法：每張切片400倍顯微鏡下隨機選取 5個視野：①陽性細(xì)胞數(shù)：每個視野記數(shù)100個細(xì)胞，計算5個視野的陽性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)分為4級：陽性細(xì)胞數(shù)1%～24% 為1分；25%～49%為2分；50%～74%為3分；大于75%為4分。②染色強度：無著色0分；淺黃色1分；黃或深黃色2分；褐或棕褐色3分，上述兩項相乘為分級標(biāo)準(zhǔn)：<4分定義為低表達(dá)，≥4分定義為高表達(dá)〔1〕。觀察結(jié)果由兩名病理科醫(yī)師采取盲法判斷。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t和χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。

2 結(jié) 果

圖1 bFGF、CREB和Bcl-2在卵巢癌中的表達(dá)(DAB，×200)

2.1CREB、bFGF和Bcl-2在卵巢惡性腫瘤、卵巢良性腫瘤和正常卵巢組織中表達(dá) bFGF和Bcl-2陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)，CREB陽性表達(dá)位于細(xì)胞核(圖1)。在82例卵巢惡性腫瘤中，bFGF、CREB和Bcl-2分別有例57、62例和57例呈高表達(dá)；在20例卵巢良性腫瘤中，bFGF、CREB和Bcl-2分別有6例、8例和5例呈高表達(dá)；在18例正常卵巢組織中，bFGF、CREB和Bcl-2分別有2例、4例和2例呈高表達(dá)。bFGF、CREB和Bcl-2在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于卵巢良性腫瘤、正常卵巢組織(P=0.000)。

2.2bFGF、CREB和Bcl-2蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系 bFGF、CREB和Bcl-2表達(dá)與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著的相關(guān)性，在分期較高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，bFGF、CREB和Bcl-2的表達(dá)明顯增高，其中bFGF的表達(dá)與組織的分化程度有關(guān)，但三者的表達(dá)年齡、腫瘤的組織學(xué)類型均無顯著的相關(guān)性。見表1。

表1 bFGF、CREB和Bcl-2蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系(n)

2.3bFGF、CREB和Bcl-2三者表達(dá)的相關(guān)性 在卵巢惡性腫瘤組織中，bFGF與CRER(r=0.426，P=0.000)、CREB與Bcl-2(r=0.673，P=0.000)和Bcl-2與bFGF(r=0.540，P=0.000)蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)。

3 討 論

卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤的增殖及凋亡的失控密切相關(guān)。CREB是一種真核生物細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控因子，其功能表現(xiàn)在生命活動的許多方面,包括調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、生理節(jié)奏、細(xì)胞的發(fā)育與生存、成癮性和抑郁以及學(xué)習(xí)記憶等〔2〕。bFGF可通過與其受體FGFR結(jié)合激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化CREB調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄,表現(xiàn)出多種生理功能，MEK/ERK及PI3K/PKB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是由bFGF激活的經(jīng)典信號通路,與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)〔3，4〕。前期研究表明bFGF可快速激活人卵巢癌CAOV3細(xì)胞ERK活性，誘導(dǎo)CREB磷酸化以及抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)，并顯著抑制了無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，推測bFGF可能通過激活MEK/ERK1/2/CREB/bcl-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制卵巢癌CAOV3細(xì)胞凋亡〔5〕。

bFGF可以促進(jìn)多種細(xì)胞的有絲分裂活動，而且可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在腫瘤中，bFGF可以自分泌的方式促進(jìn)有絲分裂和血管的發(fā)生〔6〕。因此bFGF的表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)，如結(jié)直腸癌，卵巢癌等〔7，8〕。

近來研究發(fā)現(xiàn)CREB在許多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中均扮演著重要的角色，如淋巴瘤，乳腺癌，黑素瘤和肝癌〔9〕。CREB高表達(dá)與細(xì)胞增殖和存活正相關(guān),抑制CREB表達(dá),可阻遏腫瘤細(xì)胞惡性增殖，增強化療藥物敏感性，前期研究結(jié)果也表明，RNA干擾降低CREB的表達(dá)可以降低卵巢癌細(xì)胞的增殖〔10〕，但在卵巢癌組織中CREB的表達(dá)情況研究較少。

眾多免疫組化研究結(jié)果均表明，在惡性腫瘤中，CREB的表達(dá)均比良性腫瘤及正常組織明顯增高，如結(jié)直腸癌非小細(xì)胞型肺癌，前列腺癌〔11，12〕，同樣，在卵巢癌中CREB的表達(dá)也比卵巢正常組織明顯增高〔13〕，與本研究結(jié)果一致。研究表明，在結(jié)直腸癌中，bFGF的表達(dá)與腫瘤的分期，分級，淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著分期和分級的增加，bFGF的表達(dá)增高〔7〕。在卵巢癌中，有研究表明，隨著FIGO分期及分級的增加， bFGF的表達(dá)增加〔8〕。本研究表明CREB在腫瘤的進(jìn)展中起著重要的作用。

Bcl-2基因即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因,其基因產(chǎn)物通過抵抗細(xì)胞凋亡,延長細(xì)胞壽命導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目增加,因此Bcl-2家族蛋白是多種腫瘤的存活因子，它的過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生，進(jìn)展，以及化療藥物的抵抗有關(guān)〔14〕。

研究表明，在惡性腫瘤中，Bcl-2的表達(dá)均比正常組織明顯增高，如胃癌，卵巢癌等〔15，16〕。并且發(fā)現(xiàn)在胃癌，卵巢癌中，Bcl-2蛋白的陽性表達(dá)均與腫瘤的分期有關(guān)，與年齡以及腫瘤的分化程度沒有關(guān)系〔15，16〕。與本研究結(jié)果一致。

在卵巢癌中，bFGF、CREB和Bcl-2的表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征的關(guān)系一直存在爭議，這些研究之間的差異，一方面推測可能是統(tǒng)計的樣本量有差別；另一方面國際上沒有統(tǒng)一免疫染色的評分標(biāo)準(zhǔn)，搜集的病例不處于同一分期；另一方面可能由于應(yīng)用免疫組織化學(xué)試劑、方法及實驗條件不同，這些都可能造成研究結(jié)果存在差異。但研究結(jié)果均表明，與卵巢良性腫瘤及正常組織相比,卵巢癌中bFGF、CREB和Bcl-2的表達(dá)均明顯增高。

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