車(chē)媛梅 張 一 應(yīng) 杰

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院傳染科,江西 南昌 330006)

肝纖維化是各種原因引起慢性肝損傷共有的病理改變，也是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)，其病理的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(HSC)表型轉(zhuǎn)換后產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)。在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中，過(guò)氧化物酶體增殖物液活受體(PPAR)γ衰竭是HSC轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵分子變化機(jī)制之一。研究表明脂聯(lián)素不但在脂質(zhì)及葡萄糖代謝中具有作用，同時(shí)具有抗肝纖維化作用，是否PPARγ能上調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)、協(xié)同抗纖維化目前研究甚少。本研究通過(guò)PPARγ激動(dòng)劑和(或)拮抗劑作用于活化的HSC，在mRNA及蛋白質(zhì)水平分析PPARγ與脂聯(lián)素表達(dá)的關(guān)系，及其對(duì)HSC增殖的影響，為肝纖維化治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑 大鼠HSC-T6，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所徐列明教授；羅格列酮購(gòu)自瑞士Alexis公司；GW9662購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗大鼠PPARγ抗體及兔抗大鼠Adiponectin抗體購(gòu)自武漢博士德公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；總RNA提取試劑盒及RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；總蛋白提取試劑盒購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自北京Solavbia公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠HSC-T6用含10%胎牛血清及濃度為100 U/ml雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，放于37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，隔天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)傳代。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的最佳濃度給藥〔1〕，分為羅格列酮組(10 μmol/L)，GW9662阻斷組(1 μmol/L)，羅格列酮+GW9662組(10 μmol/L羅格列酮 + 1 μmol/L GW9662)，空白對(duì)照組(單純用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞)。

1.3.2MTT法檢測(cè)各組對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后培養(yǎng)24 h，棄凈培養(yǎng)液，按照實(shí)驗(yàn)分組加入藥物每孔200 μl；對(duì)照組用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h后，加入無(wú)菌MTT溶液(5 mg/ml)20 μl及150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min。采用492 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A值)，計(jì)算細(xì)胞的增殖率，增殖抑制率=〔(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值〕×100%。

1.3.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PPARγ和脂聯(lián)素mRNA的表達(dá) 總RNA的提取及cDNA的合成按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。引物由上海生物工程公司合成。PPARγ擴(kuò)增片段222 bp，上游5′-3′CCC TGG CAA AGC ATT TGT AT,下游5′-3′ACT GGC ACC CTT GAA AAA TG;脂聯(lián)素?cái)U(kuò)增片段178 bp，上游5′-3′GTT CTC TTC ACC TAC GAC CAG,下游5′-3′GGA AGA GAA GAA AGC CAG TAA。參照 β-actin擴(kuò)增片段522 bp，上游5′-3′TGG GAC GAT ATG GAG AAG AT下游5′-3′ATT GCC GAT AGT GAT GAC CT；擴(kuò)增后電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描，脂聯(lián)素、PPARγ 與β-actin的比值為各自mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4蛋白質(zhì)免疫印跡(Western印跡)檢測(cè)脂聯(lián)素和PPARγ蛋白的表達(dá) 細(xì)胞中總蛋白提取按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，用Umax2100XL掃描儀拍照，并用Quantity-One凝膠分析軟件分析目的條帶的灰度值，脂聯(lián)素、PPARγ 與β-actin的比值為各自蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞增殖的結(jié)果 GW9662組(0.893±0.027)、GW9662+羅格列酮組(0.779±0.027)及空白對(duì)照組(0.998±0.029)的A值均較羅格列酮組(0.678±0.029)明顯升高(t值分別為16.331、21.975、19.5，均P<0.01)。

2.2RT-PCR檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞脂聯(lián)素和PPARγ mRNA表達(dá) ①羅格列酮組脂聯(lián)素mRNA相對(duì)表達(dá)量(1.273±0.045)較空白對(duì)照組(0.693±0.065)、GW9662組(0.653±0.075)、GW9662+羅格列酮組(0.633±0.093)升高(t值分別為12.264、10.733、12.690，P<0.01)。②羅格列酮組PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量(1.633±0.015)較空白對(duì)照組(0.457±0.015)、GW9662組(0.403±0.015)、GW9662+羅格列酮組(0.450±0.026)升高(t值分別為8.619、7.089、4.343，P<0.01)。③GW9662能同時(shí)阻斷羅格列酮對(duì)PPARγ及脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)。④PPARγ和脂聯(lián)素mRNA表達(dá)有正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)指數(shù)為0.970，P=0.000)。見(jiàn)圖1。

2.3Western印跡檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞脂聯(lián)素和PPARγ蛋白表達(dá) ①羅格列酮組(1.124±0.007)脂聯(lián)素蛋白相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組(0.734±0.043)、GW9662組(0.744±0.082)、GW9662+羅格列酮組(0.744±0.064)升高(t值分別為7.969、10.240、15.274，P<0.01)。②羅格列酮組PPARγ蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.036±0.028)較空白對(duì)照組(0.649±0.005)、GW9662組(0.655±0.006)、GW9662+羅格列酮組(0.648±0.004)升高(t值分別為23.450、24.208、23.990，P<0.01)。③GW9662能同時(shí)阻斷羅格列酮對(duì)PPARγ及脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)。④PPARγ和脂聯(lián)素蛋白表達(dá)有正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)指數(shù)為0.966，P=0.001)。見(jiàn)圖2。

M：相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A：羅格列酮組；B：GW9662組；C：羅格列酮+GW9662組；D：空白對(duì)照組；下圖同

圖2 Western印跡檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞脂聯(lián)素、PPARγ蛋白表達(dá)

3 討 論

脂肪組織是一個(gè)活躍的內(nèi)分泌器官，其分泌的細(xì)胞因子如脂聯(lián)素和瘦素參與肝纖維化發(fā)展。在病毒性肝炎及非酒精性脂肪性肝病研究中發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素參與肝臟脂肪變、炎癥活動(dòng)、纖維化〔2〕。Musso等〔3〕報(bào)道脂聯(lián)素水平與肝臟纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。Kaser 等〔4〕報(bào)道各種病因的肝纖維化患者血漿脂聯(lián)素水平均明顯升高，且其血漿濃度與Child-Pugh 分級(jí)相關(guān)。Sohara等〔5〕報(bào)道38例肝硬化患者血清脂聯(lián)素水平與肝功能Child-Pugh分級(jí)呈正相關(guān)。Ding 等〔6〕在大鼠HSC培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，靜息的HSC可以表達(dá)合成脂聯(lián)素，脂聯(lián)素可以減少增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)而抑制活化的HSC增殖及遷移，并促進(jìn)活化的HSC 凋亡以抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。Adachi等〔7〕報(bào)道高分子量脂聯(lián)素通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑抑制HSC增殖。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ可通過(guò)多途徑、多層次維持HSC靜止表型，各途徑間有多種交互作用，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)，將生理濃度的脂聯(lián)素與人單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞共同孵育，脂聯(lián)素呈劑量依賴性地增加基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP)-1mRNA的表達(dá)，而PPARγ激動(dòng)劑能誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞上脂聯(lián)素受體的表達(dá)〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明羅格列酮激動(dòng)PPARγ的表達(dá)，同時(shí)也上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)，且這種激動(dòng)作用可被特異性阻斷劑GW9662阻斷，提示羅格列酮的激動(dòng)作用是通過(guò)PPARγ途徑實(shí)現(xiàn)的。相關(guān)性分析結(jié)果提示在HSC中細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ與脂聯(lián)素的表達(dá)調(diào)控有一定相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道PPARγ的靶基因是脂聯(lián)素一致〔10〕。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)脂聯(lián)素具有抑制肝纖維化的作用，其機(jī)制可能與PPARγ的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控有關(guān)，通過(guò)提高PPARγ與脂聯(lián)素的表達(dá)，從而抑制HSC增殖，達(dá)到阻斷肝纖維化進(jìn)展的目的。

4 參考文獻(xiàn)

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