王冬梅 趙 丹 殷盛明 李盛龍 徐 紅 傅 雷 宮得正 于德欽 孟 旭

(大連醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116044)

帕金森病(PD)是中老年人常見(jiàn)的進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵直、步態(tài)紊亂及體位不平衡等〔1，2〕。此病主要病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失及胞質(zhì)內(nèi)路易小體出現(xiàn)。PD的確切病因目前還不清楚，一般認(rèn)為與多種因素有關(guān)，包括遺傳、環(huán)境、衰老等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),PD不僅與黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺含量減少有關(guān),可能也與阿片受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中代謝障礙有關(guān)。有關(guān)kappa受體表達(dá)異常是否參與MPTP小鼠的發(fā)病機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步探討本病的發(fā)病機(jī)制,以C57BL/6小鼠皮下注射MPTP成功誘發(fā)PD模型，觀察不同腦區(qū)的kappa受體表達(dá)的改變，探討MPTP對(duì) C57BL/6小鼠腦內(nèi)kappa受體免疫反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物分組 選取健康C57BL/6小鼠(大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，24只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機(jī)分為模型組(MPTP+NS)、對(duì)照組(NS+NS)。模型組每日上午11∶30皮下注射MPTP(溶于三蒸水，pH8.5)20 mg/kg,連續(xù)8 d，對(duì)照組給等量生理鹽水，連續(xù)8 d。

1.2免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物經(jīng)4%水合氯醛(400 mg/kg,i.p.)麻醉，1%和4%的多聚甲醛灌流，取腦放入4%的多聚甲醛中固定，含30%蔗糖的磷酸鹽緩沖液(PBS)中4℃過(guò)夜，切取50 μm厚的冠狀腦片，PBS漂洗10 min×2，與1%BSA孵育30 min；加入第一抗體(kappa-Ab，1∶100)4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗10 min×2；分別與相應(yīng)的生物素化羊抗兔二抗(1∶400)室溫振蕩孵育1 h，PBS漂洗10 min×2；與卵白素化生物素復(fù)合物A∶B ∶PBS(1∶1∶400)室溫振蕩孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法顯色?？瞻讓?duì)照腦片第一抗體以PBS代替。HPIAS系列彩色病理圖文分析系統(tǒng)定量計(jì)數(shù)kappa受體陽(yáng)性細(xì)胞。選取模型組和對(duì)照組小鼠各5只。測(cè)量框的面積為3 120.4 μm2(43.1 μm×72.4 μm)，選取四個(gè)部位計(jì)數(shù)，取平均值。計(jì)算測(cè)量框內(nèi)免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

1.3Western印跡法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)kappa受體蛋白表達(dá)含量的改變 動(dòng)物經(jīng)4%水合氯醛(400 mg/kg,i.p.)麻醉，取腦，每50～100 mg腦組織加Trizol 1 ml，勻漿；加0.2 ml氯仿?lián)u勻，離心15 min；有機(jī)相(大約0.8 ml)中加異丙醇1.5 ml混勻，室溫靜置10 min，4℃離心10 min，棄上清，用含0.3 mol/L鹽酸胍的95%乙醇溶液洗滌沉淀20 min×3次，每次洗滌后4℃離心5 min。真空干燥10 min，用1%SDS溶解沉淀(50℃，3 h)，4℃離心10 min，上清移新管，分光光度計(jì)595 nm波長(zhǎng)測(cè)定蛋白含量；SDS-PAGE電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，加一抗(kappa受體抗體1∶100)，4℃過(guò)夜后TTBS洗10 min×3，加二抗，37℃ 1 h，TTBS洗10 min×3，加DAB顯色，適時(shí)終止反應(yīng)，干燥、包存。干燥纖維素膜用數(shù)碼相機(jī)拍照后，用凝膠分析系統(tǒng)(上海天能公司生產(chǎn))定量分析kappa受體蛋白含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

模型組與對(duì)照組比，在腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、額葉皮層區(qū)(Fr)和門(mén)區(qū)(Hilus)，單位面積內(nèi)kappa受體免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，kappa受體免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度明顯較低，而且kappa受體免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞排列紊亂，見(jiàn)圖1，表1，表2。

表1 小鼠相關(guān)腦區(qū)kappa免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目

表2 小鼠相關(guān)腦區(qū)kappa免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的灰度

Western印跡法蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組比，海馬和皮層處kappa受體蛋白(0.14±0.03、0.15±0.01)表達(dá)明顯低于對(duì)照組(0.17±0.02、0.26±0.03,P<0.05)，見(jiàn)圖2。這些結(jié)果均提示 kappa受體在MPTP處理后的C57BL/6小鼠腦內(nèi)表達(dá)明顯減少，kappa受體表達(dá)的減少參與了PD的發(fā)病機(jī)制。

圖1 小鼠相關(guān)腦區(qū)kappa受體免疫反應(yīng)染色結(jié)果(Bar=100 μm)

1：對(duì)照組海馬；2：模型組海馬；3：對(duì)照組額葉皮層；4：模型組額葉皮層

3 討 論

PD是一種常見(jiàn)中老年的基底節(jié)神經(jīng)元進(jìn)行性退行改變，主要累及黑質(zhì)及黑質(zhì)-紋狀體多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)，以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵直等運(yùn)動(dòng)障礙為特征，此時(shí)病人黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元喪失通?？蛇_(dá)50%～60%，紋狀體多巴胺減少可達(dá)60%～80%〔3，4〕。PD的發(fā)病包括①有致病因素存在的無(wú)病期；②PD病理過(guò)程已開(kāi)始但無(wú)臨床癥狀的臨床前期；③出現(xiàn)PD典型臨床癥狀的臨床期。PD患者從發(fā)病到臨床診斷的時(shí)間通常為2～3年，很難借助臨床資料深入研究早期PD。早期PD動(dòng)物模型，制備方法成熟，可重復(fù)性高，可模擬人類(lèi)PD早期病理特征，所以有極大的優(yōu)勢(shì)。MPTP被吸毒者誤用后產(chǎn)生了在生化、病理和臨床特征上酷似PD的表現(xiàn)。MPTP模型已成為研究PD發(fā)病機(jī)制、神經(jīng)生化、病理解剖、運(yùn)動(dòng)及精神障礙、藥物作用等方面的最佳工具，并觸發(fā)了人們對(duì)環(huán)境毒素(除草劑、殺蟲(chóng)劑)在PD致病作用中的研究。

MPTP本身不具有神經(jīng)毒性，但可以穿越血腦屏障，并主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞和5-羥色胺能神經(jīng)元內(nèi)的單胺氧化酶B作用后轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘缘腗PP+，然后釋放到細(xì)胞外，不能穿越血腦屏障，而是經(jīng)由多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)末梢和胞體，選擇性破壞黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致黑質(zhì)細(xì)胞體、紋狀體神經(jīng)末梢、多巴胺遞質(zhì)的大量減少。單胺氧化酶B或DAT特異性抑制劑、DAT基因缺失等能抵抗MPTP的毒性作用；相反，高表達(dá)DAT可導(dǎo)致MPTP毒性增強(qiáng)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),阿片肽類(lèi)物質(zhì)代謝障礙也參與PD錐體外系癥狀的產(chǎn)生機(jī)制，關(guān)于阿片肽變化與多巴胺代謝障礙之間的關(guān)系,經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦啡肽和內(nèi)啡肽可使動(dòng)物出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)不能、肌張力增高和肌僵直等現(xiàn)象,阿片受體拮抗劑納洛酮可逆轉(zhuǎn)腦室內(nèi)注射所致的運(yùn)動(dòng)不能等癥狀,而L-多巴也可逆轉(zhuǎn)肌張力增高和肌僵直,提示阿片肽與PD的多巴胺代謝障礙存在某種聯(lián)系。

已有報(bào)道說(shuō)明Kappa受體相關(guān)的通路參與PD的發(fā)生〔5〕，給予PD大鼠Kappa受體激動(dòng)劑時(shí)，其PD癥狀有所緩解〔6〕的功能，其中1/3紋狀體阿片受體位于多巴胺能神經(jīng)元上，余2/3位于紋狀體或由紋狀體發(fā)出的神經(jīng)元上〔7〕。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道，能與kappa受體特異性結(jié)合的強(qiáng)啡肽能夠隨著劑量的改變而對(duì)PD模型中的多巴胺能神經(jīng)元有損傷、保護(hù)作用〔8〕，其機(jī)制是否與kappa受體有關(guān)，尚不清楚。本研究提示kappa受體的表達(dá)參與PD的發(fā)生，kappa受體蛋白表達(dá)明顯降低很可能就是PD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，支持了相關(guān)報(bào)道，在治療中給予kappa受體激動(dòng)劑能夠緩解PD癥狀〔9〕。因此,進(jìn)一步探討PD與kappa受體之間的關(guān)系,以尋求更有效的緩解PD的治療方法,可能會(huì)為此類(lèi)疾病治療開(kāi)辟新途徑。

4 參考文獻(xiàn)

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