溫 娜 唐澤波 張 宇 劉興吉 金 宏 齊 玲 于洪泉

(吉林醫(yī)藥學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林 吉林 132013)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，以惡性居多〔1，2〕。膠質(zhì)瘤一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，即處于晚期，很多患者不能手術(shù)，因此化療在膠質(zhì)瘤治療中占極為重要的地位。五味子多糖(CPSC)就是從五味子成熟干燥果實中提取出來的，具有多種藥理活性的復合物。研究表明CPSC具有抗腫瘤活性〔3～6〕，但其抗腫瘤作用機制尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CPSC可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長〔7〕。本文將進一步研究CPSC對體外培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細胞凋亡的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 裸鼠膠質(zhì)瘤細胞本實驗室提??；CPSC(北華大學提供)；細胞培養(yǎng)基RPMI1640 (Thermo公司)，小牛血清和0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，Bax、Bcl-2抗體(北京中杉公司)。

1.2提取原代裸鼠膠質(zhì)瘤細胞 復蘇及培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細胞，以2×106/75 cm2密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，每隔1～3 d換液1次。

1.3ELISA法測定裸鼠膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清中Bax和Bcl-2蛋白表達 將裸鼠腦腫瘤細胞以1×104/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板中，實驗分為對照組(不含藥物)和CPSC組(200，400，800 μg/ml)，藥物作用48 h，每組設(shè)5個復孔。取細胞培養(yǎng)上清，將上清液與包被液按1∶1比例包被后4℃過液。封閉后加入Bax和Bcl-2抗體(1∶500稀釋)于4℃過夜。加入二抗室溫下孵育2 h，加顯色液室溫避光顯色。于自動酶標儀492 nm處測定A值，并計算Bax和Bcl-2比值。

1.4細胞免疫組織化學法檢測Bax和Bcl-2蛋白在裸鼠膠質(zhì)瘤細胞陽性表達率 按上述方法和分組用不同劑量CPSC作用細胞48 h后，吸出培養(yǎng)上清，取出玻片，10%甲醛溶液固定30 min，滅活后一抗過夜，二抗室溫孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察，以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性著色，按照公式計算Bax和Bcl-2表達陽性率(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1CPSC對體外培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細胞上清中Bax和Bcl-2蛋白表達水平 不同濃度CPSC作用裸鼠膠質(zhì)瘤細胞48 h后，與對照組(0 μg/ml)比較，其培養(yǎng)上清中Bcl-2蛋白表達水平均下降(P<0.01)；Bax的表達值隨CPSC濃度的增加而遞增。多糖組Bax/Bcl-2均升高，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組裸鼠膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清中Bax和Bcl-2蛋白表達

2.2細胞免疫組織化學法檢測各組裸鼠膠質(zhì)瘤細胞Bax和Bcl-2陽性表達率 CPSC作用裸鼠膠質(zhì)瘤細胞48 h后，400和800 μg/ml多糖組Bax蛋白陽性表達率均明顯升高，與對照組(0 μg/ml)比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，400和800 μg/ml多糖組Bcl-2蛋白陽性表達率均下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組裸鼠膠質(zhì)瘤細胞Bax和Bcl-2陽性表達率(%)

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率都很高，病程難以控制，目前治療方案仍然是手術(shù)切除輔以放療和化療等綜合治療為主。誘導或促進腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的基本方法之一。五味子抗腫瘤作用主要集中在木脂素和多糖部位〔4〕。其中，CPSC是其抗腫瘤的主要成分之一，其藥理研究表明，具有抑瘤〔4～6〕等作用。因此，CPSC具有預防和治療腫瘤的潛在價值。

細胞凋亡是廣泛存在于生理和病理狀態(tài)下的有序的受一系列基因嚴格控制的程序化死亡，是級聯(lián)式基因表達的結(jié)果，可以通過多種形式誘導凋亡發(fā)生。目前已發(fā)現(xiàn)許多與凋亡相關(guān)的基因，其中Bcl-2家族對凋亡起重要調(diào)節(jié)作用〔8〕，Bax和Bcl-2是其家族的兩個重要成員代表，其作用相互拮抗，Bax則促進細胞凋亡，Bcl-2抑制細胞凋亡。Bcl-2/Bax之間的比例是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關(guān)鍵因素，研究表明〔9〕，當Bcl-2蛋白表達增加時，在細胞內(nèi)可形成Bcl-2/Bax異源二聚體，抑制凋亡的產(chǎn)生。當Bax表達加強時則形成同源二聚體Bax/Bax將加速細胞凋亡，因此，Bax和Bcl-2表達的比例對細胞的凋亡與否起決定性作用〔10〕。

本研究結(jié)果顯示CPSC可能通過上調(diào)Bax蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白激活線粒體信號傳導路徑，引起細胞凋亡，從而使裸鼠膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生凋亡。但其機制還需進一步深入研究。

4 參考文獻

1徐俊杰，于洪泉，趙 偉，等.西蘭花多肽對C6膠質(zhì)瘤細胞的誘導凋亡作用〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版)，2013;39(1)：8-11.

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3于 赫，李 冀，齊 彥.五味子多糖對肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用及其免疫學機理初探〔J〕.中醫(yī)藥信息，2010;27(2)：26-7.

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7溫 娜，唐澤波，袁 瑞，等.五味子粗多糖對腦膠質(zhì)瘤細胞生長的作用〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(12)：2837-8.

8Hardwick JM，Chen YB，Jonas EA.Multipolar functions of Bcl-2 proteins link energetics to apoptosis〔J〕.Trends Cell Biol，2012;22(6)：318-28.

9劉 英，郭世杰，孫景輝.缺氧缺血性腦損傷新生大鼠心肌細胞凋亡及凋亡蛋白Bax，Bcl-2表達的變化〔J〕.臨床兒科雜志，2009;27(12)：1172-6.

10Reed JC.Proapoptotic multidomain Bcl-2/Bax-family proteins：mechanisms，physiological roles，and therapeutic opportunities〔J〕.Cell Death Differ，2006;13(8)：1378-86.