溫 娜 唐澤波 張 宇 劉興吉 金 宏 齊 玲 于洪泉

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，以惡性居多〔1，2〕。膠質(zhì)瘤一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，即處于晚期，很多患者不能手術(shù)，因此化療在膠質(zhì)瘤治療中占極為重要的地位。五味子多糖(CPSC)就是從五味子成熟干燥果實(shí)中提取出來的，具有多種藥理活性的復(fù)合物。研究表明CPSC具有抗腫瘤活性〔3～6〕，但其抗腫瘤作用機(jī)制尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CPSC可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)〔7〕。本文將進(jìn)一步研究CPSC對(duì)體外培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室提??；CPSC(北華大學(xué)提供)；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640 (Thermo公司)，小牛血清和0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，Bax、Bcl-2抗體(北京中杉公司)。

1.2提取原代裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞 復(fù)蘇及培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以2×106/75 cm2密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，每隔1～3 d換液1次。

1.3ELISA法測(cè)定裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 將裸鼠腦腫瘤細(xì)胞以1×104/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(不含藥物)和CPSC組(200，400，800 μg/ml)，藥物作用48 h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。取細(xì)胞培養(yǎng)上清，將上清液與包被液按1∶1比例包被后4℃過液。封閉后加入Bax和Bcl-2抗體(1∶500稀釋)于4℃過夜。加入二抗室溫下孵育2 h，加顯色液室溫避光顯色。于自動(dòng)酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)定A值，并計(jì)算Bax和Bcl-2比值。

1.4細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白在裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率 按上述方法和分組用不同劑量CPSC作用細(xì)胞48 h后，吸出培養(yǎng)上清，取出玻片，10%甲醛溶液固定30 min，滅活后一抗過夜，二抗室溫孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性著色，按照公式計(jì)算Bax和Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1CPSC對(duì)體外培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平 不同濃度CPSC作用裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組(0 μg/ml)比較，其培養(yǎng)上清中Bcl-2蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.01)；Bax的表達(dá)值隨CPSC濃度的增加而遞增。多糖組Bax/Bcl-2均升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

2.2細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bax和Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率 CPSC作用裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后，400和800 μg/ml多糖組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯升高，與對(duì)照組(0 μg/ml)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，400和800 μg/ml多糖組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bax和Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率(%)

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率都很高，病程難以控制，目前治療方案仍然是手術(shù)切除輔以放療和化療等綜合治療為主。誘導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的基本方法之一。五味子抗腫瘤作用主要集中在木脂素和多糖部位〔4〕。其中，CPSC是其抗腫瘤的主要成分之一，其藥理研究表明，具有抑瘤〔4～6〕等作用。因此，CPSC具有預(yù)防和治療腫瘤的潛在價(jià)值。

細(xì)胞凋亡是廣泛存在于生理和病理狀態(tài)下的有序的受一系列基因嚴(yán)格控制的程序化死亡，是級(jí)聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果，可以通過多種形式誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。目前已發(fā)現(xiàn)許多與凋亡相關(guān)的基因，其中Bcl-2家族對(duì)凋亡起重要調(diào)節(jié)作用〔8〕，Bax和Bcl-2是其家族的兩個(gè)重要成員代表，其作用相互拮抗，Bax則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax之間的比例是決定細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，研究表明〔9〕，當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)增加時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)可形成Bcl-2/Bax異源二聚體，抑制凋亡的產(chǎn)生。當(dāng)Bax表達(dá)加強(qiáng)時(shí)則形成同源二聚體Bax/Bax將加速細(xì)胞凋亡，因此，Bax和Bcl-2表達(dá)的比例對(duì)細(xì)胞的凋亡與否起決定性作用〔10〕。

本研究結(jié)果顯示CPSC可能通過上調(diào)Bax蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白激活線粒體信號(hào)傳導(dǎo)路徑，引起細(xì)胞凋亡，從而使裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。但其機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

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