周 波

(南京森林警察學(xué)院，江蘇 南京 210023)

衰老肌細胞的胞外溶液的滲透壓改變是肌細胞衰老的更明顯的特征。近年研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，有一種物質(zhì)同時與增齡過程中肌細胞滲透壓改變和“鈣火花”反應(yīng)的變化有著密切關(guān)系，該物質(zhì)是存在于肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)膜并接近T管系統(tǒng)的膜蛋白Mitsugumin，由于其分子量是29 kD，因而被稱為MG29蛋白。研究者們發(fā)現(xiàn)〔2，3〕，在疲勞、衰老等多種狀態(tài)下肌細胞中MG29的基因表達明顯下降。而動物實驗證明，在衰老過程中，MG29與肌細胞中鈣儲運能力以及Ca2+對肌纖維滲透壓改變的反應(yīng)能力都存在著密切關(guān)系〔4，5〕?？梢奙G29是與衰老和肌肉功能衰退直接有關(guān)。閆萬軍〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，抗阻訓(xùn)練可以使老齡大鼠肌組織中MG29的基因表達增加，肌肉功能增強。本文旨在研究抗阻訓(xùn)練結(jié)合蛋白補充對肌細胞中MG29的表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗對象 雄性SD大鼠3月齡8只，20月齡32只，購自中山大學(xué)實驗動物中心，在廣東藥學(xué)院動物房飼養(yǎng)并完成實驗。飼養(yǎng)條件：自由飲食，自然光照，室溫20℃～22℃，濕度40%～45%，分籠飼養(yǎng)。

1.2實驗分組 將32只20月齡大鼠(老齡大鼠)隨機分成四組，分別為老齡負重訓(xùn)練組(老訓(xùn)組，負重體重的30%)、老齡負重訓(xùn)練+乳清蛋白組(老訓(xùn)喂養(yǎng)組)、老齡無訓(xùn)練乳清蛋白組(老無訓(xùn)喂養(yǎng)組)和老齡無訓(xùn)練普通喂食對照組(老齡對照組)。8只3月齡大鼠作為成年對照組(成年對照組)。

1.3儀器與試劑 ZH-PT型國產(chǎn)動物實驗跑臺，安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、脂褐素測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所MG29抗體：采用美國Santa Cruz生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的MG29抗體，貨號為：Mg29(A-14)：sc-23441。二抗采用同一家公司生產(chǎn)的驢-羊抗體，貨號為：IgG-HRP：sc-2024。以β-actin為內(nèi)參蛋白。乳清蛋白粉購自加拿大Protein公司。動物飼料購自廣東藥學(xué)院動物實驗中心。

1.4實驗方案

1.4.1運動方案 兩個訓(xùn)練組采用跑臺負重跑方式進行。訓(xùn)練前稱量大鼠體重，根據(jù)體重給大鼠穿上相當(dāng)于體重30%重量的“鐵片衣”(本研究組自制)，令大鼠在0°坡度的跑臺上以10 m/min的速度跑1.5 min，間歇2 min為一組，每次訓(xùn)練跑4組。完成訓(xùn)練后令大鼠在訓(xùn)練房內(nèi)自由活動1 h后再放回籠中。每天訓(xùn)練，每周三休息1 d，共訓(xùn)練10 w。

成年對照組正常飼養(yǎng)，每天將大鼠放出籠自由活動1 h。負重訓(xùn)練+乳清蛋白組和無訓(xùn)練乳清蛋白組喂食時，每只大鼠的飼料中摻入5 g乳清蛋白粉。

1.4.2衰老標(biāo)志物檢驗 ①肌組織脂褐素的測試：取大鼠股直肌組織200 mg,制備組織勻漿。采用F-4500熒光光度計進行測試，具體操作步驟與方法依試劑盒所附的說明書進行。②SOD、MDA的測試：從大鼠尾尖部采血20 μl，3 000 r/min離心15 min，取血清進行紫外分光光度計測試，具體步驟與方法依試劑盒說明書所示進行操作。

1.4.3Western印跡檢測大鼠股直肌組織中MG29蛋白的基因表達 ①蛋白質(zhì)抽提：測試組織取自大鼠后右側(cè)大腿股直肌，截取250 mg作為測試對象，加1 ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑，勻漿后抽提總蛋白；實驗對象為細胞樣品，每份樣品取106～107細胞。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，去PBS加0.1-1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑抽提總蛋白。②蛋白質(zhì)測定：按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量測試試劑盒操作說明進行操作，測定樣品蛋白濃度。③SDS-PAGE：將準(zhǔn)備好的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進第一個孔中，電泳分離蛋白。④蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上：按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，在30 mA恒流條件下，4℃轉(zhuǎn)移過夜。⑤膜的封閉和抗體孵育：膜在5%BSA溶液中孵育1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合物(20℃室溫)；封閉過的膜加入一級抗體孵育1.5 h，使抗原抗體結(jié)合(20℃室溫)；加入HRP標(biāo)記的二級抗體以結(jié)合以及抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1 h。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。⑥結(jié)果檢測：采用化學(xué)發(fā)光法檢測。膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育后，經(jīng)X光膠片曝光顯影。圖片掃描保存為數(shù)字文件，并用Image J分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值進行數(shù)字化。然后用目的蛋白MG29的灰度值除以內(nèi)參蛋白Actin的灰度值得到MG29的相對含量。⑦結(jié)果校正：目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值以校正誤差。所得結(jié)果就代表了樣品目的蛋白的相對含量。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠血清及肌組織衰老標(biāo)志物的變化 成年對照組與老訓(xùn)組和老訓(xùn)喂養(yǎng)組SOD活性差異顯著(P<0.05)，而顯著高于老齡其他各組(P<0.01)，老訓(xùn)組和老訓(xùn)喂養(yǎng)組SOD活性顯著高于老齡其他各組(P<0.05)；成年組與老齡各組MDA差異顯著(P<0.01)；成年組與老齡各組之脂褐素差異顯著(P<0.01)。見表1。

表1 大鼠血清SOD活性、MDA濃度及肌組織脂褐素含量比較

2.2大鼠肌組織MG29蛋白的變化 老訓(xùn)喂養(yǎng)組MG29蛋白含量(1.22±0.16)明顯高于老訓(xùn)組(1)，老無訓(xùn)喂養(yǎng)組(0.68±0.09)及老齡對照組(0.70±0.33)(P均<0.05)，與成年對照組無顯著差異(1.27±0.31，P>0.05)。老訓(xùn)組MG29含量高于老齡對照組(P<0.05)，老無訓(xùn)喂養(yǎng)組與老齡對照組無差異(P>0.05)。見圖1。

1：老訓(xùn)組；2：老訓(xùn)喂養(yǎng)組；3：老無訓(xùn)喂養(yǎng)組；4：老齡對照組；5：成年對照組

3 討 論

衰老過程中，抗氧化系統(tǒng)功能降低，抗氧化酶的活性也明顯減弱，因此，在衰老研究領(lǐng)域，血液或組織中的SOD的活性被作為衰老的標(biāo)志物。與此同時，衰老過程中機體過多的氧自由基會攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并生成脂質(zhì)過氧化物——MDA。因此，血清或組織勻漿中的MDA水平也反映了機體的抗氧化水平，衰老時組織中MDA水平明顯升高。此外，衰老過程中，組織和器官上都會沉積一種叫做脂褐素的物質(zhì)，就像人們臉上的老年斑。故在衰老研究中MDA和脂褐素也作為衰老印跡而被視為衰老的標(biāo)志物。

研究證明，衰老大鼠血清SOD活性明顯低于年輕大鼠〔7〕，而血清MDA值則明顯高于年輕大鼠〔8〕。這是老齡大鼠抗氧化功能下降的表現(xiàn)，反過來，以上兩項指標(biāo)也可以被作為衡量被試衰老程度的客觀指標(biāo)。表明本研究20月齡老齡大鼠出現(xiàn)了明顯的衰老跡象，而“抗阻訓(xùn)練”和“抗阻訓(xùn)練結(jié)合乳清蛋白喂養(yǎng)”可以有效地提高大鼠機體抗氧化能力。本研究表明訓(xùn)練和乳清蛋白喂養(yǎng)以及兩者結(jié)合等干預(yù)措施都未能有效地影響MDA的形成和清除。脂褐素值的情形與MDA值相似，可見，老齡大鼠肌組織脂褐素的沉積也是不可逆的，抗阻訓(xùn)練和乳清蛋白喂養(yǎng)干預(yù)對于脂褐素的產(chǎn)生和清除都沒有明顯的影響。

MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最后產(chǎn)物。衰老或疾病等許多因素都會導(dǎo)致機體產(chǎn)生過多的氧自由基，這些氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此生成脂質(zhì)過氧化物，如MDA。本研究中雖然抗阻訓(xùn)練和抗阻訓(xùn)練結(jié)合乳清蛋白喂養(yǎng)可以改善大鼠SOD活性，即提高機體抗氧化能力，但對于MDA值的影響卻不明顯。這表明大鼠肌組織的衰老在一定程度上是不可逆的。

研究表明〔9〕，抗阻訓(xùn)練可以有效地抑制衰老性肌肉丟失，促進肌纖維肥大和再生。這些研究結(jié)構(gòu)都是有關(guān)肌肉結(jié)構(gòu)蛋白的合成問題。MG29被證明是影響肌細胞神經(jīng)傳導(dǎo)的重要功能蛋白，而且衰老過程中MG29蛋白的基因表達出現(xiàn)明顯的下降，那么抗阻訓(xùn)練或其他干預(yù)能否有效地抑制MG29下降甚至促進再生是證明衰老性肌肉功能下降的可逆性的重要證據(jù)。

有研究證明隨著年齡的增長，肌肉中MG29蛋白的含量呈現(xiàn)出下降的趨勢，這可能是老年人肌肉功能衰退的重要原因之一〔10〕。本研究結(jié)果再次證明了此結(jié)論，因此，合理的營養(yǎng)干預(yù)結(jié)合抗阻訓(xùn)練能夠有效地增加衰老大鼠肌組織MG29蛋白的基因表達，從而有可能從神經(jīng)傳導(dǎo)的功能水平上抑制衰老。目前關(guān)于肌肉抗衰老的營養(yǎng)干預(yù)的研究有許多，通常補充乳清蛋白、大豆蛋白和酪蛋白， 而研究表明對于肌肉丟失的抑制和促進老年肌肉合成最有效的是乳清蛋白〔11〕。這也是本研究選用乳清蛋白的主要原因。而且本研究結(jié)果證明，抗阻訓(xùn)練乳結(jié)合清蛋白喂養(yǎng)在促進衰老肌肉抗氧化能力的增強和MG29基因表達增強方面明顯優(yōu)于單純抗阻訓(xùn)練。

在衰老性肌肉丟失的研究中發(fā)現(xiàn)，抗阻訓(xùn)練可以有效地抑制肌肉丟失，而老年人肌肉功能的可訓(xùn)練性也可以維持到甚至90歲以上，然而這種可持續(xù)性的機制并不十分清楚，至少在神經(jīng)元的研究方面沒有發(fā)現(xiàn)有力的支持性結(jié)果。MG29作為一種膜蛋白，它的表達增強無疑提高肌細胞的興奮性是十分有利的，這可以說是肌肉功能增強的機制之一。

抗阻訓(xùn)練結(jié)合乳清蛋白喂養(yǎng)可以最有效地促進衰老大鼠肌組織中MG29蛋白的基因表達的增強，并提高肌組織抗氧化能力?？棺栌?xùn)練以及抗阻訓(xùn)練結(jié)合乳清蛋白喂養(yǎng)不能明顯降低衰老大鼠肌組織中的脂褐素、MDA代謝產(chǎn)物，盡管肌肉SOD活性已明顯提高，但肌組織中的其他衰老標(biāo)志物沒有明顯變化，說明肌組織中的代謝產(chǎn)物并不容易被清除或抑制其生成。

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