劉 磊 王宏英 方艷秋 譚 巖 趙雪儉

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長春 130021)

人參的藥學(xué)開發(fā)已由總皂苷類藥物向分組皂苷及單體皂苷方向發(fā)展。人參二醇組皂苷(PDS)為從人參中提取的活性成分，有與地塞米松類似的抗失血性休克與抗內(nèi)毒素(LPS)休克的作用，而無糖皮質(zhì)激素樣副作用〔1，2〕。本研究通過觀察LPS致LPS休克大鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)水平，NF-κB蛋白表達(dá)情況及炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-1β，腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-6含量，觀察PDS和地塞米松(DEX)對腦組織損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 PDS(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室提供)；DEX注射液(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭萬股份有限公司)；大腸桿菌LPS血清型0111和B4：購于Sigma公司，5%葡萄糖溶液配制。SOD活力和MDA含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠IL-6，IL-1β和TNFαELISA試劑盒購自上海奧生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動物分組與處理〔3〕健康Wistar大鼠28只，雌雄不拘，鼠齡4～7個月，體重280～350 g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供和喂養(yǎng)。隨機(jī)分為四組(每組7只)：對照(control)組、內(nèi)毒素休克(LPS)組、地塞米松(LPS+DEX)組、人參二醇組皂苷(LPS +PDS)組。大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，分離一側(cè)股動脈插動脈插管，通過壓力傳感器連接RM6000型四導(dǎo)生理記錄儀記錄血壓；分離一側(cè)股靜脈備給藥用。待血壓平穩(wěn)后記錄正常的心率、血壓。實(shí)驗(yàn)前control和LPS組大鼠靜注5%葡萄糖溶液5 ml/kg，LPS+Dex組靜注Dex(2 mg/kg)葡萄糖溶液5 ml/kg，LPS+PDS組靜注PDS(45 mg/kg)葡萄糖溶液5 ml/kg。10 min后除control組外均靜脈注射LPS 4 mg/kg，control組靜脈注射等量的葡萄糖溶液。以血壓降到實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)血壓的2/3判斷為休克狀態(tài)。4 h后處死動物，斷頭，無菌采集大腦皮質(zhì)，生理鹽水沖洗干凈，腦組織迅速放于液氮中凍存。

1.3腦組織中MDA含量和SOD活力的檢測 組織稱重后，加入9倍冰生理鹽水，電動勻漿機(jī)中研磨成10%勻漿，3 500 r/min，離心10 min。取上清液，G250法測定總蛋白含量，以供生化指標(biāo)檢測。用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA水平。

1.4免疫印跡方法檢測腦組織中NF-κB(P65)蛋白量變化 取大鼠的腦組織，立即放入預(yù)冷的RIPA buffer裂解緩沖液中，冰上超聲勻漿后，4℃，12 000 r/min離心30 min，取上清，G250法測定總蛋白含量，將蛋白樣品濃度調(diào)整為40 μg/μl。10%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜2 h，10%脫脂奶封閉液1 h。棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的一抗工作液(抗p65及抗β-actin 抗體)，4℃振搖孵育過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3 次，加入1∶3 000 稀釋的相應(yīng)二抗，室溫反應(yīng)1 h；TBST 洗膜3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，BandScan5.0分析軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白條帶的灰度值與β-actin 蛋白條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5腦組織內(nèi)TNF-α和IL-6、IL-1β含量測定 ELISA檢測腦組織勻漿上層清中TNF-α和IL-6、IL-1β含量。

2 結(jié) 果

2.1PDS對LPS休克大鼠平均動脈壓(MABP)的影響 見表1。對照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中血壓平穩(wěn)，MABP為(15.69±3.75)kPa。注入LPS后5 min各實(shí)驗(yàn)組大鼠均進(jìn)入休克狀態(tài)，LPS組從休克第45分鐘開始血壓進(jìn)行性下降，直至處死時該組動物均已進(jìn)入瀕臨死亡狀態(tài)。然而，PDS組與DEX組在LPS組進(jìn)入明顯的失代償階段后，仍維持穩(wěn)定而持久的代償性變化直至4 h處死，與LPS組比較差異顯著性(P<0.05)。

表1 各組大鼠MABP的變化

2.2大鼠腦組織中MDA含量與SOD活力測定 與對照組比較，LPS組大鼠腦組織SOD活力顯著降低，MDA水平顯著增高(P<0.05)。PDS+LPS組與DEX+LPS組大鼠腦組織MDA含量均明顯低于LPS組，而SOD活力明顯增加，見表2。

表2 各組大鼠腦組織內(nèi)SOD活性、MDA含量

2.3大鼠腦組織NF-κB P65蛋白表達(dá)量變化 Western印跡結(jié)果顯示，LPS組大鼠腦組織NF-κB表達(dá)水平較對照組明顯增強(qiáng)，PDS+LPS和DEX+LPS組可抑制該蛋白的表達(dá)，使其表達(dá)豐度與正常大鼠一致。見圖1。

圖1 大鼠腦組織NF-κB(P65)蛋白表達(dá)量變化

2.4腦組織內(nèi)炎癥因子IL-1β，TNF-α和IL-6水平 LPS組大鼠腦組織勻漿IL-1β，TNF-α和IL-6水平顯著高于對照組。PDS和DEX可以顯著抑制大鼠腦組織中IL-1β，TNF-α和IL-6的分泌水平(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織IL-1β，IL-6、TNF-α水平比較

3 討 論

人參提取物PDS具有與DEX一樣的誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄活性的作用，能夠提高機(jī)體促炎因子產(chǎn)生的自限性，避免炎癥介質(zhì)泛濫所導(dǎo)致的自身破壞性全身性炎癥反應(yīng)綜合征，具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景〔3〕。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，PDS可明顯降低LPS休克所致的腦組織損傷作用，其作用可能與PDS下調(diào) TLR4 mRNA表達(dá)有關(guān)。本文在應(yīng)用LPS誘導(dǎo)的大鼠休克模型的基礎(chǔ)上，初步探索PDS對LPS休克所致的腦組織損傷作用的分子機(jī)制。

本文發(fā)現(xiàn)PDS有與DEX類似作用，能夠提高LPS休克大鼠平均動脈血壓，發(fā)揮抗LPS休克的效應(yīng)。研究認(rèn)為，LPS休克時自由基的毒性作用是神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡的主要因素，自由基的濃度或劑量是神經(jīng)元損傷程度及進(jìn)程的主要因素之一〔5，6〕。自由基在休克腦損傷中發(fā)揮重要作用。PDS與DEX一樣可以有效增加SOD 活性、減少M(fèi)DA 含量，對抗自由基損傷、保護(hù)腦組織的作用。

前期研究〔7，8〕發(fā)現(xiàn)，LPS可以與細(xì)胞膜表面的CD14分子以及TLR4結(jié)合而促發(fā)對腦組織細(xì)胞的損傷作用。本研究進(jìn)一步證實(shí)LPS可以降低LPS休克組大鼠腦組織Iκ-Bα mRNA表達(dá)結(jié)論的可靠性。細(xì)胞中NF-κB的抑制蛋白IκBα表達(dá)降低是活化的NF-κB釋放并進(jìn)入細(xì)胞核中與相應(yīng)的靶序列結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達(dá)的關(guān)鍵因素〔9〕。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PDS可以阻抑LPS所致的腦組織內(nèi)急性炎性細(xì)胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6的過表達(dá)，改善由腦損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)，從而減輕神經(jīng)元壞死程度，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。IL-1β，TNF-α和IL-6被證實(shí)NF-κB活化后入核調(diào)控的靶基因，因而推測，PDS通過抑制NF-κB信號通路的活化減少LPS休克組大鼠腦組織中炎癥因子的釋放，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

本研究證實(shí)，PDS通過提高SOD活力增加自由基的清除，抑制LPS激活的NF-κB信號通路，減少炎癥因子對腦組織的損傷作用，有可能代替DEX，成為有應(yīng)用前景的輔助新藥。

4 參考文獻(xiàn)

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