侯 茜 郭 美 張 帆

(甘肅中醫(yī)學(xué)院生物教研室 甘肅中醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所 甘肅中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

免疫系統(tǒng)的衰老是機體衰老的主要原因〔1〕。而免疫衰老是以胸腺衰老為先導(dǎo)的從中樞到外周的衰老進程，胸腺衰老可以作為免疫衰老最重要的標(biāo)志〔2〕。因此，在抗衰老研究中，保護胸腺，延緩胸腺萎縮具有不可替代理論和實際意義。胸腺細(xì)胞過度凋亡是胸腺萎縮的重要因素〔3〕，而活性氧自由基與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔4〕。黨參主治脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，熱病傷津，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消渴等癥，可以作為人參的替代品〔5〕?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黨參具有增強免疫力、抗氧化、抗缺氧、抗疲勞、抗腫瘤、增強記憶和提高學(xué)習(xí)能力等功能〔6〕。目前，關(guān)于黨參延緩免疫衰老的研究還未見報道?，F(xiàn)代研究已證實，D-半乳糖可以誘導(dǎo)免疫衰老，是有效的免疫衰老研究模型〔7〕。本實驗通過觀察黨參水煎劑對亞急性衰老模型小鼠胸腺組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織自由基代謝和胸腺細(xì)胞凋亡率方面的影響，研究其抑制胸腺萎縮，延緩免疫衰老的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級昆明種小鼠100只，雄性，2月齡，體重(20±2)g，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2藥品試劑及儀器 黨參：產(chǎn)自甘肅文縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系晉玲教授鑒定為優(yōu)質(zhì)道地藥材。制成含生藥濃度為1 g/ml的水煎劑，置4 ℃?zhèn)溆?；D-半乳糖：上海中秦試劑有限公司，批號20111220；維生素E軟膠囊：青島雙鯨藥業(yè)有限公司，批號110608；考馬斯亮藍(lán)蛋白濃度、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號111203；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。BS224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Feb-80臺式高速離心機：金壇市恒豐儀器廠；OLYMPUS BX60光學(xué)顯微鏡：JAPAN；VIS-723N可見分光光度計：北京瑞克分析儀器公司；EPICS XL流式細(xì)胞儀：美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3動物分組 小鼠隨機分為5組，空白對照組、衰老模型組、維生素E組、黨參低劑量組和黨參高劑量組，每組20只。

1.4造模及給藥 每日每只小鼠頸背部皮下注射5%D-半乳糖溶液，注射量為1 000 mg/kg，空白對照組注射等量生理鹽水，共42 d。從造模第11天開始黨參高、低劑量組每日上午分別按相當(dāng)于生藥量15 g/kg和5 g/kg灌服黨參水煎劑，維生素E組灌胃給予維生素E溶液50 mg/kg，空白對照組和衰老模型組給予等量生理鹽水灌胃。按體重調(diào)整給藥量，連續(xù)30 d。

1.5觀察指標(biāo)與測定

1.5.1光鏡觀察胸腺組織病理變化 采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剖取胸腺，取一葉胸腺立即投入10%甲醛溶液中固定。取固定好的胸腺組織經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色后，鏡下觀察組織大體形態(tài)變化。

1.5.2胸腺組織MDA含量及SOD活性的測定 采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剖取胸腺，去除周圍脂肪組織，預(yù)冷生理鹽水洗凈血液，吸干水分并稱重，加9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，采用手工勻漿法制成10%的胸腺組織勻漿，操作在冰水浴中進行，3 000～4 000 r/min離心10 min，取適量上清液，按試劑盒說明進行操作。按公式計算出各組小鼠胸腺組織蛋白濃度、MDA含量及SOD活性。

1.5.3胸腺組織細(xì)胞凋亡率的測定 采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剖取胸腺，用PBS漂洗除去血液，將組織置于培養(yǎng)皿內(nèi)，加適量PBS，用眼科剪剪碎，加0.25%Trypsion-EDTA溶液等體積與組織混合，室溫下攪動10～20 min，過200目尼龍網(wǎng)，將細(xì)胞懸浮于含1%胎牛血清的PBS中，混勻，1 000 r/min 離心5 min，去上清，將細(xì)胞重新懸浮于含1%胎牛血清的PBS中，再經(jīng)PBS洗1次后將細(xì)胞懸浮起來，用加樣器將細(xì)胞懸液打入75%冷乙醇中混勻封口，置于4 ℃冰箱中固定12 h。然后取出，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2次，加RNAase(0.5 mg/ml)消化，37 ℃ 30 min，加入PI(25 μg/ml)染色，避光20 min，流式細(xì)胞儀檢測，計算G0/G1期之前的A0峰(凋亡峰)，以峰值面積計算凋亡量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1黨參水煎劑對胸腺組織形態(tài)的影響 空白對照組：胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)分界清晰，皮質(zhì)較厚，胸腺細(xì)胞排列整齊，網(wǎng)狀細(xì)胞較少；髓質(zhì)染色淺，淋巴細(xì)胞較少而稀，上皮網(wǎng)狀細(xì)胞較多而顯著，可見胸腺小體。衰老模型組：胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)分界不清，皮質(zhì)較薄，胸腺組織中脂肪顯著增加，局部出現(xiàn)纖維化，細(xì)胞排列紊亂，胸腺細(xì)胞明顯減少。維生素E組：胸腺組織形態(tài)接近空白對照組，皮質(zhì)與髓質(zhì)界線明顯，皮質(zhì)較厚，胸腺細(xì)胞數(shù)量明顯增加。黨參低劑量組：胸腺組織形態(tài)介于空白對照組與衰老模型組之間，皮質(zhì)與髓質(zhì)分界較明顯，部分區(qū)域皮質(zhì)較薄，胸腺細(xì)胞排列不齊，數(shù)量減少。黨參高劑量組：胸腺組織形態(tài)接近空白對照組，與維生素E組類似，皮質(zhì)與髓質(zhì)分界明顯，皮質(zhì)較厚，胸腺細(xì)胞數(shù)量明顯增加。見圖1。

2.2黨參水煎劑對亞急性衰老小鼠胸腺組織MDA含量和SOD活性的影響 與空白對照組比較，衰老模型組和黨參低劑量組小鼠胸腺MDA含量顯著增高(P<0.05)，SOD活力下降(P<0.05)；與衰老模型組比較，維生素E組、黨參低劑量組和黨參高劑量組小鼠胸腺MDA含量顯著下降(P<0.05)，SOD活力顯著增加(P<0.05)；與維生素E組比較，黨參高劑量組MDA含量和SOD活力值無明顯差異(P>0.05)，黨參低劑量組介于維生素E組和衰老模型組之間。見表1。

衰老模型組

維生素E組

黨參低劑量組

黨參高劑量組

與空白對照組比較：1)P<0.05；與衰老模型組比較：2)P<0.05

2.3黨參水煎劑對亞急性衰老小鼠胸腺組織細(xì)胞凋亡率的影響 與空白對照組〔(1.34±0.28)%〕比較，衰老模型組胸腺細(xì)胞凋亡率顯著增加〔(14.91±0.83)%，P<0.05〕，維生素E組、黨參低劑量組和黨參高劑量組凋亡率有下降趨勢〔(3.38±0.36)%、(4.90±0.32)%、(3.85±0.23)%〕但與空白對照組相比亦有顯著差異(P<0.05)；與衰老模型組比較，各組小鼠胸腺細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P<0.05)；與維生素E組比較，黨參高劑量組無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

自由基又稱游離基，是在體內(nèi)氧化代謝過程中產(chǎn)生的，它作為一種氧化劑，對生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類、核酸等均有破壞作用，還可通過改變血液流變特性，引起微循環(huán)障礙導(dǎo)致局部缺血，使細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)而受損〔8〕。同時，機體內(nèi)存在自由基抗氧化酶防御系統(tǒng)，及時清除產(chǎn)生的自由基，保持體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除始終處于動態(tài)平衡。但當(dāng)機體抗氧化酶活性下降時，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基得不到及時的清除，進而導(dǎo)致退行性疾病、腫瘤及衰老等現(xiàn)象的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡是保持自身組織穩(wěn)定、調(diào)控自身細(xì)胞的增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細(xì)胞主動性死亡過程〔9〕。細(xì)胞凋亡對衰老的影響主要表現(xiàn)在：一是通過凋亡的形式清除功能障礙或受損的細(xì)胞，并由纖維組織代替，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；二是清除不可再生的細(xì)胞，清除后不能由其他組織替代，進而導(dǎo)致病理改變。因此，細(xì)胞凋亡增加將導(dǎo)致組織細(xì)胞數(shù)量減少，功能減退而出現(xiàn)老年性進行性病理過程〔10〕。胸腺細(xì)胞凋亡率增加是影響胸腺萎縮的重要因素之一。

自由基與細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系。在諸多凋亡的誘因中，體內(nèi)代謝或外源性因素產(chǎn)生的自由基均被證實可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，大量研究表明自由基參與了細(xì)胞凋亡過程〔4〕。自由基代謝失衡和細(xì)胞凋亡過度均是影響衰老的重要因素。

本實驗結(jié)果表明，黨參水煎劑可通過改善胸腺組織病理形態(tài)、平衡自由基代謝和降低細(xì)胞凋亡率幾方面起到延緩胸腺萎縮，增強機體免疫功能，延緩衰老的作用。胸腺組織自由基代謝恢復(fù)平衡狀態(tài)可能是細(xì)胞凋亡率降低的影響因素之一。

4 參考文獻

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