周新木 陳麗榮

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科, 浙江 杭州 321000)

由于肝細胞癌易轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，預(yù)后差，如何能在肝細胞癌尚未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移前及早預(yù)測、診斷，并及時采取有效措施就成為能否進一步提高肝細胞癌治療效果的關(guān)鍵。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)屬于硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員，是通過糖基磷脂酰肌醇結(jié)合于細胞表面。在細胞的生長、分化、遷移中起著很重要的作用〔1〕。熱休克蛋白(HSP)70是熱休克蛋白家族中一員，主要調(diào)節(jié)細胞周期及凋亡，并在腫瘤的發(fā)生中起作用〔2，3〕。谷氨酰胺合成酶(GS)作為Wnt信號通路的靶基因，伴隨β-catenin的異常激活而導(dǎo)致許多人類疾病的發(fā)生〔4〕。本研究運用組織芯片技術(shù),通過免疫組織化學(xué)Envision法檢測肝細胞癌中GPC3、HSP70 和 GS的表達，分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，探討它們在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的作用。

1 材料與方法

1.1臨床材料 2001年1月至2010年12月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院和浙江省麗水市中心醫(yī)院手術(shù)切除肝細胞癌標本182例，全部患者術(shù)前均未進行放、化療和免疫治療。92例癌旁肝組織選自距肝細胞癌邊緣5 cm以上的癌旁肝組織。182例中男143例，女39例；年齡38～87(平均61)歲；腫瘤最大徑<5 cm 125例，腫瘤最大徑≥5 cm 57例；高分化(Edmonson分級1～2)81例，低分化(Edmonson分級3～4)101例；有脈管內(nèi)瘤栓55例，無脈管內(nèi)瘤栓127例；TNM分期Ⅰ和Ⅱ期117例，Ⅲ和Ⅳ期65例；肝外轉(zhuǎn)移29例(肺15例，椎體10例，肋骨2例，腎上腺1例，腦1例)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移12例，無轉(zhuǎn)移141例；術(shù)后復(fù)發(fā)75例，無復(fù)發(fā)107例。

1.2小組織芯片制作 復(fù)習(xí)組織切片,在相應(yīng)的蠟塊上選定有代表性的區(qū)域并做標記,用自制組織芯片制作工具在一新的空白受體蠟塊上穿孔(直徑1.8 mm),再用相同內(nèi)徑的空心管從選取的供體蠟塊中穿取組織,準確放入空白蠟塊的小孔內(nèi),按序操作,直至將所有組織標本種植于空白蠟塊中。每例取腫瘤及瘤旁組織各1處。通過切片、撈片制作組織芯片。

1.3方法 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)EnVision法, 組織芯片4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化后，采用高壓鍋進行抗原修復(fù)。鼠抗人GPC3單克隆抗體(clone 1G12)即用型試劑，購自福州邁新公司；鼠抗人HSP70單克隆抗體(clone W27)工作濃度1∶50，購自北京中杉公司；鼠抗人GS單克隆抗體(clone GS-6)工作濃度1∶450，購自美國Chemicon International Inc.公司?？乖?jīng)pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液高壓鍋煮沸修復(fù)處理，然后進行免疫組織化學(xué)染色過程。最后鏡下控制DAB 顯色,蘇木素復(fù)染和中性樹膠封固。每次染色均用pH7.2～7.4 PBS溶液代替一抗作陰性對照,用已知的陽性切片作陽性對照。

1.4結(jié)果判定 GPC3和GS陽性表達定位于細胞質(zhì)， HSP70陽性表達定位于細胞質(zhì)和細胞核。采用二級計分法,首先按染色強度評分: 無色為0分, 淡黃色為1分,棕黃色為2分, 棕褐色為3分; 然后按陽性細胞率評分: 腫瘤細胞內(nèi)無陽性染色者為0分,陽性細胞率<10%為0分, 10%～25%為1分, >25%～50%為2分，>50%～75%為3分, >75%為4分。將二者相加得綜合免疫組化評分：≤3分為陰性，>3分陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1組織芯片質(zhì)量 組織芯片排列整齊，共取材182例，實際有效182例，有效率100%。

2.2肝細胞癌和癌旁肝組織GPC3、HSP70與GS蛋白的表達比較 GPC3在肝細胞癌和癌旁肝組織中主要表達于細胞質(zhì)，與癌旁肝組織(0.6%)比較，肝細胞癌高表達，陽性表達率為 79.1%，差異顯著(χ2=130.005，P<0.05)。HSP70在肝細胞癌和癌旁肝組織中主要表達于細胞質(zhì)和細胞核，與癌旁肝組織(0.6%)比較，肝細胞癌高表達，陽性表達率為 79.7%，差異顯著(χ2=132.172，P<0.05)。GS在肝細胞癌和癌旁肝組織中主要表達于細胞質(zhì)，與癌旁肝組織(4.3%)比較，肝細胞癌高表達，陽性表達率為 77.5%，差異顯著(χ2=128.235，P<0.05)。見圖1。

2.3GPC3、HSP70和GS的表達與肝細胞癌臨床病理特征的關(guān)系 GPC3在不同的分化程度、有無脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期和有無轉(zhuǎn)移的肝細胞癌患者比較中差異顯著(P<0.05)；HSP70和GS在TNM分期、有無轉(zhuǎn)移和有無術(shù)后復(fù)發(fā)的肝細胞癌患者比較中差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1 肝細胞癌不同臨床特征中 GPC3、HSP70和GS蛋白表達比較〔n(%)〕

圖1 肝癌組織GPC3、HSP70及GS表達(Envision，×100)

3 討 論

GPC3屬于硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員，是通過糖基磷脂酰肌醇結(jié)合于細胞表面。在細胞的生長、分化、遷移中起著很重要的作用〔1〕。Libbrecht等〔5〕的實驗結(jié)果顯示，肝硬化或異型增生轉(zhuǎn)化為肝癌，其特點為GPC3表達的明顯增強，肝硬化組織中的小灶性病變?nèi)绯霈F(xiàn)GPC3陽性則強烈提示為肝癌。本研究結(jié)果顯示，GPC3陽性表達率為79.1%，與癌旁肝組織比較差異顯著，并與文獻報道一致〔6，7〕，提示GPC3在肝細胞癌發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。本研究結(jié)果還顯示，GPC3的表達強度與肝細胞癌分化程度、脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期和轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤細胞分化越差，臨床分期越高，則GPC3蛋白表達程度越高，提示GPC3與惡性腫瘤細胞侵襲性密切相關(guān)，高表達可促進惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，這可能與GPC3可抑制成纖維細胞生長因子介導(dǎo)的肝癌細胞增殖，同時降低肝癌細胞與Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白之間的黏附力，增強細胞的遷移和侵襲能力有關(guān)〔8〕。

HSP70屬于熱休克蛋白家族中一員，主要調(diào)節(jié)細胞周期及凋亡，并在腫瘤的發(fā)生中起作用〔2，3〕。Tommaso等〔9〕報道HSP70在絕大多數(shù)肝細胞癌出現(xiàn)免疫組化陽性表達，包括早期肝細胞癌和高分化肝細胞癌，良性結(jié)節(jié)病變則陰性，可作為惡性腫瘤標記。本研究結(jié)果顯示，HSP70陽性表達見于肝細胞癌的細胞質(zhì)和細胞核中，陽性表達率為79.7%，與癌旁肝組織比較差異顯著，結(jié)合HSP70功能，可能與HSP70抑制細胞凋亡，促進腫瘤進展有關(guān)。本研究結(jié)果提示HSP70表達增加與肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并且是肝細胞癌發(fā)展和惡化的重要標志。其機制可能是HSP70的高表達介導(dǎo)癌基因與抑癌基因產(chǎn)物的構(gòu)像成熟和跨膜轉(zhuǎn)運，同時又介導(dǎo)錯配蛋白的降解，協(xié)調(diào)腫瘤細胞的蛋白質(zhì)快速代謝平衡，使腫瘤細胞得以無限增殖〔10～12〕。

GS作為Wnt信號通路的靶基因，伴隨β-catenin的異常激活而導(dǎo)致許多人類疾病的發(fā)生〔4〕。有研究報道，GS可作為AFP低水平表達的早期原發(fā)性肝癌的新的標記物〔13，14〕。本研究結(jié)果顯示，肝細胞癌GS表達水平高于癌旁肝組織，并且與TNM分期、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，臨床分期越高，蛋白表達程度越高，與文獻報道基本一致〔4，15〕。提示GS在肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，高表達可促進惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，其機制可能是肝細胞癌中GS高表達，可以使腫瘤細胞不僅依賴宿主提供谷氨酰胺而自行合成，從而為腫瘤細胞合成核苷酸提供原料，有利于克服不利的生長環(huán)境，而不斷增殖，進而增強了腫瘤的生存能力。

總之，GPC3、HSP70和GS在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著不同程度的作用，聯(lián)合檢測GPC3、HSP70和GS可能有助于判斷肝細胞癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后分析。

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