周新木 陳麗榮

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科, 浙江 杭州 321000)

由于肝細(xì)胞癌易轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，預(yù)后差，如何能在肝細(xì)胞癌尚未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移前及早預(yù)測(cè)、診斷，并及時(shí)采取有效措施就成為能否進(jìn)一步提高肝細(xì)胞癌治療效果的關(guān)鍵。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)屬于硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員，是通過糖基磷脂酰肌醇結(jié)合于細(xì)胞表面。在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移中起著很重要的作用〔1〕。熱休克蛋白(HSP)70是熱休克蛋白家族中一員，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及凋亡，并在腫瘤的發(fā)生中起作用〔2，3〕。谷氨酰胺合成酶(GS)作為Wnt信號(hào)通路的靶基因，伴隨β-catenin的異常激活而導(dǎo)致許多人類疾病的發(fā)生〔4〕。本研究運(yùn)用組織芯片技術(shù),通過免疫組織化學(xué)Envision法檢測(cè)肝細(xì)胞癌中GPC3、HSP70 和 GS的表達(dá)，分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，探討它們?cè)诟渭?xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的作用。

1 材料與方法

1.1臨床材料 2001年1月至2010年12月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院和浙江省麗水市中心醫(yī)院手術(shù)切除肝細(xì)胞癌標(biāo)本182例，全部患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療和免疫治療。92例癌旁肝組織選自距肝細(xì)胞癌邊緣5 cm以上的癌旁肝組織。182例中男143例，女39例；年齡38～87(平均61)歲；腫瘤最大徑<5 cm 125例，腫瘤最大徑≥5 cm 57例；高分化(Edmonson分級(jí)1～2)81例，低分化(Edmonson分級(jí)3～4)101例；有脈管內(nèi)瘤栓55例，無(wú)脈管內(nèi)瘤栓127例；TNM分期Ⅰ和Ⅱ期117例，Ⅲ和Ⅳ期65例；肝外轉(zhuǎn)移29例(肺15例，椎體10例，肋骨2例，腎上腺1例，腦1例)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移12例，無(wú)轉(zhuǎn)移141例；術(shù)后復(fù)發(fā)75例，無(wú)復(fù)發(fā)107例。

1.2小組織芯片制作 復(fù)習(xí)組織切片,在相應(yīng)的蠟塊上選定有代表性的區(qū)域并做標(biāo)記,用自制組織芯片制作工具在一新的空白受體蠟塊上穿孔(直徑1.8 mm),再用相同內(nèi)徑的空心管從選取的供體蠟塊中穿取組織,準(zhǔn)確放入空白蠟塊的小孔內(nèi),按序操作,直至將所有組織標(biāo)本種植于空白蠟塊中。每例取腫瘤及瘤旁組織各1處。通過切片、撈片制作組織芯片。

1.3方法 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)EnVision法, 組織芯片4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化后，采用高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)。鼠抗人GPC3單克隆抗體(clone 1G12)即用型試劑，購(gòu)自福州邁新公司；鼠抗人HSP70單克隆抗體(clone W27)工作濃度1∶50，購(gòu)自北京中杉公司；鼠抗人GS單克隆抗體(clone GS-6)工作濃度1∶450，購(gòu)自美國(guó)Chemicon International Inc.公司。抗原經(jīng)pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液高壓鍋煮沸修復(fù)處理，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色過程。最后鏡下控制DAB 顯色,蘇木素復(fù)染和中性樹膠封固。每次染色均用pH7.2～7.4 PBS溶液代替一抗作陰性對(duì)照,用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定 GPC3和GS陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)， HSP70陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。采用二級(jí)計(jì)分法,首先按染色強(qiáng)度評(píng)分: 無(wú)色為0分, 淡黃色為1分,棕黃色為2分, 棕褐色為3分; 然后按陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分: 腫瘤細(xì)胞內(nèi)無(wú)陽(yáng)性染色者為0分,陽(yáng)性細(xì)胞率<10%為0分, 10%～25%為1分, >25%～50%為2分，>50%～75%為3分, >75%為4分。將二者相加得綜合免疫組化評(píng)分：≤3分為陰性，>3分陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1組織芯片質(zhì)量 組織芯片排列整齊，共取材182例，實(shí)際有效182例，有效率100%。

2.2肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織GPC3、HSP70與GS蛋白的表達(dá)比較 GPC3在肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，與癌旁肝組織(0.6%)比較，肝細(xì)胞癌高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為 79.1%，差異顯著(χ2=130.005，P<0.05)。HSP70在肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，與癌旁肝組織(0.6%)比較，肝細(xì)胞癌高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為 79.7%，差異顯著(χ2=132.172，P<0.05)。GS在肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，與癌旁肝組織(4.3%)比較，肝細(xì)胞癌高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為 77.5%，差異顯著(χ2=128.235，P<0.05)。見圖1。

2.3GPC3、HSP70和GS的表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系 GPC3在不同的分化程度、有無(wú)脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期和有無(wú)轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌患者比較中差異顯著(P<0.05)；HSP70和GS在TNM分期、有無(wú)轉(zhuǎn)移和有無(wú)術(shù)后復(fù)發(fā)的肝細(xì)胞癌患者比較中差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1 肝細(xì)胞癌不同臨床特征中 GPC3、HSP70和GS蛋白表達(dá)比較〔n(%)〕

圖1 肝癌組織GPC3、HSP70及GS表達(dá)(Envision，×100)

3 討 論

GPC3屬于硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員，是通過糖基磷脂酰肌醇結(jié)合于細(xì)胞表面。在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移中起著很重要的作用〔1〕。Libbrecht等〔5〕的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝硬化或異型增生轉(zhuǎn)化為肝癌，其特點(diǎn)為GPC3表達(dá)的明顯增強(qiáng)，肝硬化組織中的小灶性病變?nèi)绯霈F(xiàn)GPC3陽(yáng)性則強(qiáng)烈提示為肝癌。本研究結(jié)果顯示，GPC3陽(yáng)性表達(dá)率為79.1%，與癌旁肝組織比較差異顯著，并與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔6，7〕，提示GPC3在肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。本研究結(jié)果還顯示，GPC3的表達(dá)強(qiáng)度與肝細(xì)胞癌分化程度、脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期和轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化越差，臨床分期越高，則GPC3蛋白表達(dá)程度越高，提示GPC3與惡性腫瘤細(xì)胞侵襲性密切相關(guān)，高表達(dá)可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，這可能與GPC3可抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖，同時(shí)降低肝癌細(xì)胞與Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白之間的黏附力，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力有關(guān)〔8〕。

HSP70屬于熱休克蛋白家族中一員，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及凋亡，并在腫瘤的發(fā)生中起作用〔2，3〕。Tommaso等〔9〕報(bào)道HSP70在絕大多數(shù)肝細(xì)胞癌出現(xiàn)免疫組化陽(yáng)性表達(dá)，包括早期肝細(xì)胞癌和高分化肝細(xì)胞癌，良性結(jié)節(jié)病變則陰性，可作為惡性腫瘤標(biāo)記。本研究結(jié)果顯示，HSP70陽(yáng)性表達(dá)見于肝細(xì)胞癌的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，陽(yáng)性表達(dá)率為79.7%，與癌旁肝組織比較差異顯著，結(jié)合HSP70功能，可能與HSP70抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展有關(guān)。本研究結(jié)果提示HSP70表達(dá)增加與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并且是肝細(xì)胞癌發(fā)展和惡化的重要標(biāo)志。其機(jī)制可能是HSP70的高表達(dá)介導(dǎo)癌基因與抑癌基因產(chǎn)物的構(gòu)像成熟和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)又介導(dǎo)錯(cuò)配蛋白的降解，協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)快速代謝平衡，使腫瘤細(xì)胞得以無(wú)限增殖〔10～12〕。

GS作為Wnt信號(hào)通路的靶基因，伴隨β-catenin的異常激活而導(dǎo)致許多人類疾病的發(fā)生〔4〕。有研究報(bào)道，GS可作為AFP低水平表達(dá)的早期原發(fā)性肝癌的新的標(biāo)記物〔13，14〕。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌GS表達(dá)水平高于癌旁肝組織，并且與TNM分期、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，臨床分期越高，蛋白表達(dá)程度越高，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致〔4，15〕。提示GS在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，高表達(dá)可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是肝細(xì)胞癌中GS高表達(dá)，可以使腫瘤細(xì)胞不僅依賴宿主提供谷氨酰胺而自行合成，從而為腫瘤細(xì)胞合成核苷酸提供原料，有利于克服不利的生長(zhǎng)環(huán)境，而不斷增殖，進(jìn)而增強(qiáng)了腫瘤的生存能力。

總之，GPC3、HSP70和GS在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著不同程度的作用，聯(lián)合檢測(cè)GPC3、HSP70和GS可能有助于判斷肝細(xì)胞癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后分析。

4 參考文獻(xiàn)

1Farooq M，Hwang SY，Park MK，etal.Blocking endogenous glypican-3 expression releases Hep3B from G1 arrest 〔J〕.Mol Cells，2003;15(3):356-60.

2張江蘭，張曉麗，侯 勇，等. 膀胱移行細(xì)胞癌患者癌組織HSP27和HSP70mRNA的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011；31(7)： 1108-10.

3Tommaso LD，Destro A，Seok JY，etal. The application of markers (HSP70 GPC3 and GS)in liver biopsies is useful for detection of hepatocellular carcinoma〔J〕.J Hepatol，2009;50(4):746-54.

4Osada T ,Sakamoto M, Nagawa H ,etal.Acquisition of glutamine syntheatase expression in human hepatocarcinogenesis : relation to disease recurrence and possible regulation by ubiquitin-dependent proteolysis〔J〕. Cancer,1999;85(4): 819-31.

5Libbrecht L，Severi T，Cassiman D，etal.Glypican-3 expression distinguishes small hepatocellular carcinomas from cirrhosis, dysplastic nodules and focal nodular hyperplasia-like nodules〔J〕.Am J Surg Pathol，2006;30(11)：1405-11.

6杜經(jīng)麗 ，韋立新，王玉蘭. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3等抗體在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)及其鑒別診斷意義〔J〕. 中華病理學(xué)雜志，2011;40(1)：11-6.

7葉玉清，王鳳華，黃香婷，等. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表達(dá)在肝細(xì)胞癌診斷中意義〔J〕. 中華病理學(xué)雜志，2011;40(9)：626-9.

8Kwack MH, Choi BY, Sung YK. Celluar changes resulting from forced expression of glypican-3 in hepatocellular carcinoma cells 〔J〕.Mol Cells, 2006;21(2): 224-8.

9Tommaso LD, Franchi G, Park YN,etal. Diagnostic value of HSP70, glypican-3 , and glutamine synthetase in hepatocellular nodules in cirrhosis〔J〕. Hepatology, 2007; 45(3):725-34.

10Silverstein AM, Grammatikakis N,Cochran BH,etal. P50(cdc37)binds directly to the catalytic domain of Raf as well as to a site on hsp90 that is topologically adjacent to the tetratricopeptide repeat bingding site〔J〕. J Biol Chem, 1998; 273 (32):20090-5.

11De la Rosa EJ, Veqa-Nunez E, Morales AV,etal. Modulation of the chaperone heat shock cognate 70 by embryonic (pro) insulin correlates with prevention of apoptosis〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 1998;95(17): 9950-5.

12Buzzard KA, Giaccia AJ, Killender M,etal. Heat shock protein 72 modulates pathways of stress-induced apotosis〔J〕.J Biol Chem,1998;273(27):17147-53.

13Long J ,Lang ZW, Wang HG ,etal. Glutamine synthetase as an early marker for hepatocelluar carcinoma based on proteomic analysis of resected small hepatocelluar carcinomas 〔J〕.Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2010;9(3):296-305.

14Sakamoto M. Early HCC: diagnosis and molecular markers 〔J〕.J Gastroenterol, 2009; 44(Suppl 19):108-11.

15Dal Bello B, Rosa L, Campanini N,etal. Glutamine synthetase immunostaining corrlelates with pathologic features of hepatocellular carcinoma and better survival after radiofrequency thermal ablation〔J〕. Clin Cancer Res, 2010;16(7):2157-66.