武鴻斌 譚 斌 張樹峰 辛朝光 柳福海 秦中國 汪 俊 張學(xué)輝 宋 燕 張海山

(大慶油田總醫(yī)院肛腸科，黑龍江 大慶 163000)

抑癌基因磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因,其基因突變或缺失及蛋白表達異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1～5〕。分化相關(guān)基因(NDRG)-1是van Belzen等〔2〕通過對結(jié)腸癌細胞株(HT29-D4)體外誘導(dǎo)分化過程中基因表達變化的觀察,發(fā)現(xiàn)該基因mRNA在結(jié)腸上皮細胞分化過程中表達增加,而在結(jié)直腸腫瘤表達降低,提示該基因可能與細胞分化有關(guān),二者在多種腫瘤中表達異常。本文聯(lián)合檢測大腸癌組織中PTEN及NDRG-1蛋白的表達,旨在探討PTEN及NDRG-1在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及二者的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 收集我院普外科2010年12月至2014年2月外科手術(shù)切除的原發(fā)性大腸癌手術(shù)標本114例,并取近端距離腫瘤10 cm以上的正常大腸組織80例做對照。男60例,女54例，年齡40～79〔平均(59.5±9.2)〕歲，術(shù)前均未行放療或化療。

1.2主要試劑 兔抗人PTEN多克隆抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白(SP)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，鼠抗人NDRG-1單克隆抗體購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3實驗方法 所有標本均經(jīng)甲醛液固定,常規(guī)石蠟包埋,4 μm連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟、梯度酒精水化,微波修復(fù),自然冷卻至室溫。采用免疫組織化學(xué)(S-P)法染色,DAB顯色3～5 min,蘇木素復(fù)染5 min,鹽酸酒精分化數(shù)秒,流水返藍15 min,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對照,已知陽性片作陽性對照。在光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

1.4免疫組化結(jié)果判定 PTEN主要表達于胞質(zhì)中，胞膜及胞核也有少許表達，NDRG-1主要定位于細胞質(zhì)中。陽性表達呈藍色或棕藍色顆粒。采用雙盲法統(tǒng)計實驗結(jié)果。隨機選取10個高倍視野進行計數(shù),計數(shù)陽性細胞所占的百分比：<5%為陰性(-),5%～25%為弱陽性(+),26%～50%為陽性(),≥50%為強陽性()。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行分析,率的比較采用χ2檢驗,相關(guān)性分析采用Kendall等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1PTEN、NDRG-1的表達 PTEN在大腸癌中的表達(53.38%)明顯低于其在正常大腸組織中(97.50%)(χ2=28.72，P<0.01)而NDRG-1在大腸癌中的表達(61.40%)明顯低于其在正常大腸組織(83.75%,χ2=11.24，P<0.01)。見圖1。

2.2PTEN、NDRG-1蛋白表達與大腸癌病理指標的關(guān)系 PTEN、NDRG-1蛋白表達水平與大腸癌組織分化程度均不相關(guān)(均P>0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組大腸癌組織中PTEN、NDRG-1蛋白陽性率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(均P<0.05);在Dukes A期、B期均顯著高于C期、D期(均P<0.05)。見表1。

2.3PTEN、NDRG-1在大腸癌中的相關(guān)性 大腸癌中PTEN與NDRG-1呈正相關(guān)(P=0.027 5,r=0.380)。

PTEN

NDRG-1

表1PTEN、NDRG-1蛋白表達與大腸癌病理指標的關(guān)系(n)

臨床病理指標n PTEN表達 NDRG-1表達 -+～ χ2/P值-+～ χ2/P值組織 癌組織114516328.72/0.00447011.24/0.00 正常組織802781367分化程度 低分化 3119120.42/0.525263.22/0.22 高-中分化8343403053淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有6139228.52/0.0414476.56/0.02 無5314392924Dukes分期 C+D6040208.54/0.0414466.48/0.02 A+B5414403024

3 討 論

文獻報道PTEN蛋白高表達的大腸癌細胞系，其黏附和遷移能力顯著降低，在 PTEN缺失的細胞內(nèi)重新導(dǎo)入PTEN可抑制細胞的遷移，同時也對細胞的黏附和鋪展起到暫時的抑制作用，這種黏附抑制作用可能與PTEN抑制黏著斑形成致使黏著斑數(shù)量下降有關(guān)〔1〕。然而對于在大腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中是否有PTEN基因表達水平的改變,以及這些改變所起的作用,目前報道較少。本研究提示PTEN在大腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。表明PTEN蛋白陰性表達的腫瘤更具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性。結(jié)果與國內(nèi)外其他學(xué)者〔6〕研究相似。

目前研究認為，NDRG-1基因可能廣泛參與多種生物學(xué)功能，如參與細胞生長、發(fā)育、抑制腫瘤細胞的生長，參與腫瘤細胞分化和轉(zhuǎn)移，參與應(yīng)激反應(yīng)、可被多種分化調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)表達等〔7～9〕。人們發(fā)現(xiàn)，NDRG-1基因與多種腫瘤相關(guān)。

NDRG-1基因與結(jié)直腸癌相關(guān)的研究還存在爭議。Guan等〔7〕研究提示NDRG-1基因的表達也許可抑制結(jié)腸癌細胞系的轉(zhuǎn)移潛能。而國內(nèi)學(xué)者Wang等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)在正常結(jié)直腸黏膜→結(jié)直腸腺瘤→無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌→有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中,NDRG-1基因蛋白的表達逐漸增高,并且表達有顯著性差異,但與結(jié)腸癌的分化程度無關(guān)。本研究結(jié)果提示，NDRG-1基因表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲有關(guān)。與Guan等〔7〕研究結(jié)果相似。NDRG-1基因作為近年來發(fā)現(xiàn)的一種與細胞分化相關(guān)的新基因,在多種腫瘤組織的表達還存在爭議,對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是否起抑制或促進作用,從而發(fā)揮抑癌基因或癌基因作用,還需要進一步研究證實。

目前在大腸癌中聯(lián)合檢測PTEN基因、NDRG-1基因的表達相關(guān)研究較少。國內(nèi)外學(xué)者研究二者可能相互影響〔11〕，但其具體機制還需進一步研究。本研究結(jié)果提示，大腸癌中PTEN和NDRG-1表達呈正相關(guān)，而且二者在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中可能起著重要作用，聯(lián)合檢測二者在腫瘤中的表達可能對腫瘤的發(fā)展及預(yù)后有重要意義。

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