劉學偉 程龍偉 柴淑梅 李 澤

(吉林省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科，吉林 長春 130012)

結(jié)直腸癌是十分常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預后已經(jīng)被證明是多種癌基因、抑癌基因及錯配修復基因突變共同參與調(diào)控的結(jié)果。表皮生長因子受體(EGFR)信號通路在結(jié)直腸癌發(fā)生及進展中起到至關重要的作用。KRAS基因?qū)儆赗as原癌基因家族中的一員，KRAS基因突變以點突變?yōu)橹鳎?0%多集中于12、13密碼子，且12密碼子的突變率高于13密碼子〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌KRAS基因野生型患者可在接受西妥昔單抗治療中受益，因此研究KRAS基因突變?yōu)榻Y(jié)直腸癌的預后及治療提供了參考依據(jù)。目前關于結(jié)直腸癌KRAS基因突變的報道較少，本研究應用PCR-SSCP方法檢測78例結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變表達譜情況與臨床病理因素及預后之間的相關性。

1 資料與方法

1.1組織標本 78例石蠟包埋組織標本取自吉林省腫瘤醫(yī)院，患者手術時間為2008年1月至2010年8月，其中男43例，女35例；年齡60～87〔平均(54±6)〕歲。術前均未行放化療，術后根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定第7版腫瘤TNM分期進行術后分期，并明確病理診斷。患者年齡、性別、一般狀況無明顯差異。組織標本采集獲得我院倫理委員會批準研究。78例患者由腫瘤研究委員會追蹤隨訪至2011年7月。

1.2方法 樣本DNA的提取：選擇經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色證實存在癌組織并占60%以上的蠟塊，切取3張10 μm厚組織，裝入1.5 ml已消毒離心管，常規(guī)脫蠟處理后，加入蛋白酶K至終濃度1 mg/ml，十二烷基硫酸鈉(SDS)至2%。孵育24～36 h后，離心處理(15 000 r/min，15 min，4℃)。抽取石蠟層下的液體。按照QIAamp DNA FFPF Kit試劑盒(Qiagen公司)步驟提取石蠟組織DNA，最后以30 μl洗脫液洗脫DNA，DNA產(chǎn)物用紫外分光光度計檢測DNA濃度，調(diào)節(jié)到100 μg/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

KRAS基因的PCR擴增及測序：根據(jù)Jhawer等〔2〕文獻所述，選擇擴增12/13號密碼子所需特異性引物，引物序列為：5'：AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA-3'(正義)；5'：CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3 '(反義)。PCR反應體系50 μl，包含2 μl模版DNA，10 μmol/L正、反各1 μl，25 μl Premix(含1.5 U TaKaRa Taq；10×PCR Buffer，3.0 mmol/L Mg2+；0.4 mmol/L dNTP Mix)，引物及Premix PCR檢測試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。

PCR 反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，循環(huán)30次，循環(huán)結(jié)束4℃保持，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果。選取PCR陽性DNA凝膠條帶作為目的片段，采用QIAquick PCR Purification Kit 對PCR產(chǎn)物進行回收(Qiagen公司產(chǎn)品)，后送上?；蚣夹g有限公司測序。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件行χ2檢驗Kaplan-Meier生存曲線評價KRAS基因突變與患者生存期的關系，顯著性檢驗采用Log-rank檢驗分析，Cox回歸模型進行多變量生存分析。

2 結(jié) 果

2.1KRAS基因突變結(jié)果 78例結(jié)直腸癌患者中，KRAS基因突變26例(33.3%)。KRAS基因12號密碼子突變19例(73.1%)；13號密碼子突變7例(26.9%)。KRAS基因突變均為單個堿基的點突變，未檢測出兩個或以上的堿基突變或其他形式的突變(圖1)。其中G-A突變發(fā)生頻率最高，共20例(76.9%)；其次G-T突變5例(19.2%)；G-C突變僅1例(3.9%)。KRAS基因12號密碼子突變19例，共有3種不同突變方式：GGT-GAT突變13例(50%)，導致甘氨酸Gly替換為天冬氨酸Asp；GGT-GTT突變5例(19.2%)，導致甘氨酸Gly替換為纈氨酸Val；GGT-GCT突變1例(13.9%)，導致甘氨酸Gly替換為丙氨酸Ala。13號密碼子突變7例(26.9%)，均為GGC-GAC突變，導致甘氨酸Gly替換為天冬氨酸Asp。在氨基酸替換中，Gly替換為Asp發(fā)生頻率最高，占76.9%(20/26)；其次Gly替換為Val占19.2%(5/26)；Gly替換為Ala發(fā)生頻率最低，僅占3.8%(1/26)。

2.2KRAS基因突變表達譜與臨床病理因素的關系 KRAS基因突變與結(jié)直腸癌分化程度、肝轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。KRAS基因突變與其他病理學參數(shù)如性別、年齡、腫瘤大體類型、腫瘤原發(fā)部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。78例患者追蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，KRAS基因野生型患者平均生存時間35.05個月，突變型患者是25.72個月，有統(tǒng)計學意義，(χ2=5.13,P= 0.023)。KRAS基因12號密碼子突變患者平均生存時間是25.69個月，13號密碼子突變患者是20.67個月，兩組無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單變量分析顯示KRAS基因突變與結(jié)直腸癌患者預后不良關系密切(P=0.023)，多變量分析顯示肝臟轉(zhuǎn)移、KRAS基因突變、腫瘤低分化是預后的獨立危險因素(P=0.001,0.007,0.026)。見表1，圖2。

a.KRAS基因12、13密碼子野生型基因序列;b.KRAS基因12密碼子GGT→GAT突變;c.KRAS基因12密碼子GGT→GTT突變;d.KRAS基因13密碼子GGC→GAC突變

表1KRAS基因突變表達與結(jié)直腸癌臨床病理學因素的關系〔n(%)〕

臨床病理因素n野生型突變型χ2值P值性別 男4326(60.5)17(39.5)1.66>0.05 女3526(74.3)9(25.7)年齡(歲) ≤603828(73.7)10(26.3)1.64>0.05 >604024(60.0)16(40.0)大體類型 隆起型1712(70.6)5(29.4)0.15>0.05 潰瘍型6140(65.6)21(34.4)部位 右半結(jié)腸209(45.0)11(55.0)5.72>0.05 左半結(jié)腸1813(72.2)5(27.8) 直腸4030(75.0)10(25.0)分化程度 中分化5943(55.8)16(27.1)4.21<0.05 低分化199(47.7)10(52.6)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有5035(70.0)15(30.0)0.7>0.05 無2817(60.7)11(39.3)肝轉(zhuǎn)移 無4836(75.0)12(25.0)3.90<0.05 有3016(53.3)14(46.7)TNM Ⅰ+Ⅱ3828(75.0)10(25.0)1.642>0.05 Ⅲ+Ⅳ4024(53.3)16(46.7)

圖2 78例大腸癌患者KRAS基因野生型與突變型的Kaplan-Meier生存曲線

2.3患者多因素的COX模型分析與預后相關獨立危險因素 見表2。

表2 78例大腸癌患者的多因素COX模型分析與預后相關的獨立危險因素

3 討 論

KRAS基因在結(jié)直腸癌患者突變率發(fā)生較高，本研究中KRAS基因突變率、特點的結(jié)果符合目前各研究機構(gòu)所報道KRAS基因突變的一般情況〔3，4〕。結(jié)直腸癌發(fā)生是多步驟過程，從腸道黏膜增生到良性腺瘤最后到結(jié)直腸癌的惡性轉(zhuǎn)變都與KRAS基因突變有關，因此KRAS基因突變被認為是結(jié)直腸癌發(fā)生的啟動因子，尤其是G-A堿基突變被認為在結(jié)直腸癌發(fā)生中起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)G-A突變頻率發(fā)生最高，這說明G-A突變是KRAS基因突變中的普遍現(xiàn)象。

目前對KRAS基因突變表達譜與結(jié)直腸癌臨床病理因素關系的報道不盡相同。有研究稱KRAS基因突變與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤分化程度、TNM分期等病理學因素無任何關系〔5〕。不同研究機構(gòu)發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變與某些臨床病理因素之間存在聯(lián)系〔6，7〕。Yunxia等〔8〕發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤分化程度可能與KRAS基因突變存在潛在的關系，本研究結(jié)果高于2008年ASCO會議上報道轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者35% 的KRAS 基因突變率。這可能由于本研究中樣本量受限所致或是本研究中只包括結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移，而沒有包括結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移或者其他遠處轉(zhuǎn)移的患者。結(jié)直腸癌分化程度差，惡性程度高，轉(zhuǎn)移能力強，KRAS基因突變發(fā)生可能性越高，但仍需要大樣本臨床數(shù)據(jù)來證實中國人結(jié)直腸癌患者的KRAS基因突變情況。

關于KRAS基因突變與結(jié)直腸癌的預后，仍然存在不同觀點。研究發(fā)現(xiàn)Dukes C期結(jié)直腸癌患者12號密碼子Gly突變?yōu)閂al預后差、13號密碼子G突變?yōu)锳，預后差，生存期短〔9〕。KRAS基因野生型可受上游EGFR信號通路的調(diào)控，KRAS基因發(fā)生點突變時，該基因編碼P21蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，不受上游EGFR信號影響。KRAS基因突變亞型不同，可能導致該基因空間構(gòu)象不同，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號通路不同，對化療藥物的結(jié)合位點存在差異，這就可能導致不同突變亞型對化療藥物敏感性不同，而造成預后生存期明顯不同。

綜上所述，中國結(jié)直腸癌患者的KRAS基因突變率符合目前國際各研究機構(gòu)的報道。KRAS基因的遺傳變異在結(jié)直腸癌的發(fā)生、進展中起重要作用。分析KRAS基因不同亞型突變表達譜有助于評估結(jié)直腸癌患者預后。

4 參考文獻

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