劉 丹 胡 松 趙吉順 尹燕鳳 毛擁軍

(山東外貿(mào)職業(yè)學(xué)院，山東 青島 266000)

代謝綜合征(MS)是一組以代謝紊亂為主要特征的癥候群，主要表現(xiàn)：腹型(或內(nèi)臟型)肥胖、胰島素抵抗(葡萄糖耐受不良)、特征性血脂異?！驳透呙芏戎鞍?HDL-C)血癥，高甘油三酯(TG)血癥〕、高尿酸(UA)血癥、高血壓。其中，高血壓是MS最典型特征，據(jù)報道超過1/3高血壓患者罹患有MS〔1〕。高血壓已經(jīng)成為MS患者逐漸增加的心血管事件的獨立危險因素〔2〕，是血壓平穩(wěn)MS患者的2倍〔3〕。遺傳學(xué)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)許多疾病的機(jī)制由多個基因和信號通路參與并相互作用；隨著基因圖譜的完成，運用遺傳學(xué)探討疾病的發(fā)病機(jī)制與流行病學(xué)特征成為可能。本研究通過基因芯片技術(shù)檢測eNOS(G894T)基因多態(tài)性與ACE(D/I)多態(tài)性，評估基因多態(tài)性與老年原發(fā)性高血壓患者M(jìn)S的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1入選標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：2010年1月至2012年6月,于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院特需保健科就診，60歲以上的原發(fā)性高血壓患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除繼發(fā)性高血壓、嚴(yán)重心腦血管疾病、心功能Ⅲ～Ⅳ級(NYHA分級)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<50%、心臟瓣膜病、肝腎衰竭、惡性腫瘤。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)入選368例，均告知研究方法及意義，簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1臨床資料 收集入選對象既往史、個人史、用藥史以及社會學(xué)特征；測量身高、體重、腹圍，留取尿液及空腹12 h靜脈血。安靜環(huán)境中靜息30 min以上，水銀血壓計測右上臂血壓，取3次非同日血壓的均值。參照2007年《中國成人血脂異常防治指南》〔4〕，以下標(biāo)準(zhǔn)符合3條或更多診斷為MS：血壓≥130/85 mmHg；向心性肥胖：腰圍>90 cm(男)，85 cm(女)；TG≥1.7 mmol/L；HDL-C≤1.04 mmol/L；空腹血糖≥6.1 mmol/L，糖負(fù)荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L或有糖尿病史。

1.2.2超聲心動圖檢查 均行彩色多普勒心臟超聲檢查。參照美國心臟超聲協(xié)會推薦方法，測取標(biāo)準(zhǔn)左心室長軸切面M型超聲連續(xù)的3個心動周期，測量左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)，左室后壁厚度(LVPWT)，舒張期室間隔厚度(IVST)。根據(jù)數(shù)值計算左室重量指數(shù)(LVMI)〔5〕。

1.3標(biāo)本制備 取肘靜脈血2～3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，充分混勻。

1.4儀器設(shè)備 BaiO-BE系列基因芯片檢測儀(上海百傲科技有限公司)，BE-2.0生物芯片識讀儀，離心機(jī)TGL-16B，PCR擴(kuò)增儀TC-25/H，分光光度計，電泳槽，恒溫培養(yǎng)箱DHP030，微量移液器，水浴鍋，打印機(jī)等。

1.5內(nèi)皮素-2 A894G基因多態(tài)性測定 取靜脈血，分離白細(xì)胞，提取DNA。留取肘靜脈血約3～5 ml，EDTA 50 μl抗凝處理。低滲法裂解紅細(xì)胞分離得到白細(xì)胞。飽和酚/氯仿法由白細(xì)胞中提取基因組DNA，加入TE溶解DNA，-20℃保存。將DNA溶解至蒸餾水中與單純蒸餾水作為空白對照，紫外分光光度計檢驗DNA的純度。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增ET-2基因的特異片段(反應(yīng)體系為25 μl)。反應(yīng)條件：94℃熱啟動5 min，94℃變性25 s，56℃退火25 s，72℃延伸25 s，反復(fù)40個循環(huán)，72℃延伸5 min，最后冷卻至4℃。將雜交倉中的基因芯片與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻雜交，加入顯色溶液，置于BaiO基因生物芯片識讀儀檢測，圖像Array Doctor軟件自動分析生成結(jié)果，檢測eNOS(G894T)多態(tài)性與ACE(D/I)多態(tài)性。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 評估基因分布是否符合HarDY-Weinberg平衡。采用SPSS15.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗、協(xié)方差分析及Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1基線特征 MS(+)組與MS(-)組相比，年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)、血糖、LVMI差異顯著(P<0.05)。性別、脈壓、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、UA無差異(P>0.05)(表1)。

2.2基因型及等位基因的頻率分布及關(guān)聯(lián)性分析 eNOS(G894T)基因多態(tài)性與ACE(D/I)多態(tài)性基因多態(tài)性分布符合HarDY-Weinberg平衡，樣本具有群體代表性。分析MS(+)組與MS(-)組eNOS基因多態(tài)性與ACE多態(tài)性的差異(表2)。χ2檢驗后顯示：MS(+)與MS(-)相比，eNOS基因G/G與G/T+T/T分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；eNOS、ACE基因型分布無顯著差異(P>0.05)，eNOS基因型G/G+G/T與T/T分布無顯著差異，eNOS等位基因G、T，ACE等位基因D、I分布無顯著差異。

表1 基本資料比較

表2 基因型頻率分布(n)

2.3協(xié)方差檢驗 檢驗正態(tài)分布和方差齊性后，定義協(xié)變量為性別、年齡、性別、BMI、WHR、SBP、DBP、TG、TC、HDL-C、LDL-C、LVMI，兩組基因的優(yōu)勢基因型為因變量，MS為分組變量，檢驗各組協(xié)變量與因變量的總體回歸系數(shù)相同且不為0后，進(jìn)行檢驗。結(jié)果顯示： eNOS(G894T)基因型T/T與MS無明顯相關(guān)(P=0.293)，ACE(D/I)基因型D/D與MS相關(guān)(P=0.032)。MS(+)組ACE基因型D/D協(xié)方差95%CI為1.645～1.781；MS(-)組95%CI為1.758～1.900。采用獨立樣本t檢驗分析兩組不同基因型對參數(shù)的影響(表3)。結(jié)果顯示：eNOS基因型T/T與G/T+T/T相比，年齡、UA差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ACE組基因型D/D與D/I+I/I相比，WHR、LVMI差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4二分類Logistic回歸分析 將MS有無定義為因變量，將年齡、性別、生化指標(biāo)、既往病史等影響因素及兩組基因優(yōu)勢基因型定義為自變量，進(jìn)行二分類Logistic回歸分析(表4)。MS(+)與MS(-)相比，BMI、WHR、LVMI、ACE基因型DD為MS危險因素(P<0.05)。BMI：OR=1.327，95%CI：1.151～1.531；WHR：OR=12.936，95%CI：1.704～98.218；LVMI：OR=1.417，95%CI：1.398～2.426；ACE基因型D/D：OR=2.017，95%CI：1.107～3.675。

表3 不同基因型各參數(shù)比較

表4 二分類Logistic回歸分析

3 討 論

MS患者發(fā)生心肌梗死或腦卒中的概率是正常人的3倍；死亡率則是正常人的2倍〔5〕。關(guān)于MS的分子生物學(xué)機(jī)制、基因調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍未完全明確，但已有研究證實MS的相關(guān)機(jī)制，并同時證明了MS與心肌肥厚之間的關(guān)聯(lián)性。

氧化應(yīng)激反應(yīng)及內(nèi)皮功能障礙。近期研究發(fā)現(xiàn)：MS促進(jìn)氧化應(yīng)激發(fā)生，并與鈉潴留及鹽敏感性緊密相關(guān)〔6〕。內(nèi)皮功能障礙與胰島素抵抗的相互關(guān)系已得到大型流行病學(xué)研究支持〔7〕：胰島素抵抗通過抑制細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)相關(guān)信號通路，使內(nèi)皮系統(tǒng)NO的產(chǎn)生與內(nèi)皮素-1(ET-1)分泌失衡，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。動物實驗發(fā)現(xiàn)：IGF1-PI3K(p110α)-Akt 信號通路參與調(diào)節(jié)心肌生長。胰島素生長因子(IGF1)主要由肝臟分泌，參與胎兒生長及發(fā)育；心肌細(xì)胞同樣分泌IGF1，并與其相應(yīng)的細(xì)胞表面受體IGF1R相連?；蚨ㄏ蛐∈髮嶒灐?〕證實：IGF1參與心肌細(xì)胞的生長，主要表現(xiàn)為心肌數(shù)量的增加；IGF1激活PI3K(p110α與Akt)，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增大；IGF1R轉(zhuǎn)基因小鼠心肌內(nèi)，PI3K的激活及Akt磷酸化作用顯著提高。內(nèi)皮細(xì)胞中，無生物活性的eNOS儲存在微囊蛋白1(Cav-1)內(nèi)，在磷酸化活躍的部位分解釋放有活性的eNOS，從而調(diào)節(jié)NO的合成〔9〕。以前研究認(rèn)為eNOS內(nèi)含天冬氨酸殘基，致使eNOS功能障礙，而最近研究證實eNOS基因型T/T的人群相較基因型G/G更容易出現(xiàn)eNOS合成失調(diào)。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)激活。實驗研究發(fā)現(xiàn)：RAS受內(nèi)分泌及食物攝取情況調(diào)節(jié)，食物的過度攝取導(dǎo)致脂肪組織內(nèi)血管及張素Ⅱ(AngⅡ)水平顯著升高。同樣，脂肪細(xì)胞內(nèi)血管緊張素原(Ang)及AngⅡ的大量產(chǎn)生可能增加肥胖、高血壓的發(fā)生率〔10〕。資料顯示，血管壁肌層內(nèi)，AngⅡ通過血管緊張素受體-1(AT1)干擾PI3K及Akt信號通路，進(jìn)而干擾胰島素信號，抑制胰島素的功能〔11〕；細(xì)胞因子RhoA的活性與氧化性應(yīng)激通過抑制PI3K/Akt通路、減少NO的生成參與介導(dǎo)這一過程〔1〕。近期研究顯示〔5〕：ACE基因D等位基因可能為MS的危險因素。

本研究通過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：ACE基因型DD與MS相關(guān)；但未證實eNOS基因型與MS的相關(guān)性；MS(+)組與MS(-)組之間兩組基因等位基因的Pearsonχ2檢驗無顯著差異。上述結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)論不符，考慮原因可能與地區(qū)差異及樣本量較小有關(guān)。認(rèn)為ACE基因型DD亦可能為心肌肥厚指標(biāo)LVMI的危險因素。本研究系回顧性研究，較前瞻性研究具有局限性，樣本量偏小，難以避免選擇性偏倚；有待大樣本研究進(jìn)一步證實。

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