趙曉輝 劉 鵬 葛 斌 靳鳳琳 韓子強(qiáng)

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)一科，山東 泰安 271000)

冠心病(CHD)是由多基因遺傳因素及環(huán)境因素共同作用引起的一種復(fù)雜的疾病，血液凝溶系統(tǒng)失衡在CHD的發(fā)病過(guò)程中所起的作用不容忽視。PAI-1是纖溶系統(tǒng)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，起著決定性作用，PAI基因的很多位點(diǎn)存在多態(tài)性，其基因多態(tài)性中4G/5G多態(tài)性與CHD關(guān)系密切目前國(guó)外心血管領(lǐng)域以4G/5G插入或缺失多態(tài)性研究較多考慮到人種不同及比較均衡的因素不同，PAI基因多態(tài)性與CHD及CHD危險(xiǎn)因素之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究證實(shí)。國(guó)外研究報(bào)道血漿FⅦ活性(FⅦC)增高是CHD發(fā)生的危險(xiǎn)因素〔1，2〕。 凝血因子在外源性凝血途徑中起關(guān)鍵作用，但其他研究組未能重復(fù)出類似的研究結(jié)論,可能由于血液中FⅦC的測(cè)定易受飲食、運(yùn)動(dòng)和藥物治療等因素的影響,因此FⅦ 基因多態(tài)性研究也許可以提供一條新的途徑。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 病例選自2010年4～10月泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的心內(nèi)科病房。CHD患者146例，男98例，女48例，年齡為(65±10)歲，甘油三酯〔TG，(1.84±1.58)mmol/L〕，血糖〔BS，(6.05±2.34)mmol/L〕，高密度脂蛋白〔HDL，(1.24±0.41)mmol/L〕，收縮壓〔SBP，(137.21±21.50)mmHg〕。病例符合1979年世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于缺血性心臟病的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)〔1〕，部分病例經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診〔2〕。冠脈造影時(shí)，各主要分支存在>50%狹窄定義為有意義病變，113例正常人選自人群健康體檢的隨機(jī)個(gè)體本研究人群個(gè)體之間無(wú)血緣關(guān)系作為對(duì)照，排除冠心病糖尿病高血壓患者，男71例，女42例，平均年齡(64±8)歲，TG(1.29±0.57)mmol/L，BS(5.18±0.94)mmol/L，HDL(1.35±0.39)mmol/L，SBP(128.04±14.02)mmHg。

1.2基因型的確定 采用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行基因型分析，酚-氯仿法提取外周血基因組DNA， PAI-1基因參考Margaglione等〔3〕設(shè)計(jì)引物，由海上生工(Sangon公司)合成，上游引物序列5′-CACAGAGAGAGTCTGGCCACGT-3′;下游引物序列為5′-CAGCCACTGGATTGT-CTAGGT-3′， FⅦ基因參考Bernardi等〔4〕設(shè)計(jì)引物，上游引物序列5′-TGATGACCCA-GGACTGCCT-3′，下游引物序列為5′-GGATTTGGTGCCAGGACAG-3′，由上海生工(Sangon公司)合成。反應(yīng)體系25 μl,其中含10倍PCR緩沖液2.5 μl，MgCl21.2 mmol/L，DNTP 0.24 mmol/L，模板DNA 0.12 μg，Tap酶1 U。上下游引物各0.75 μmol。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min，取5 μl PCR產(chǎn)物，加入10倍Buffer 2 μl，F(xiàn)Ⅶ基因PCR產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切，PAI-1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)BSⅡ酶切，限制性內(nèi)切酶1 μl，去離子水12 μl，55℃酶切3 h，酶切產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色檢測(cè)，確定基因型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 資料用SAS軟件行t及χ2檢驗(yàn)；應(yīng)用非條件Logistic回歸模型，對(duì)各原始變量采用逐步法建模。

2 結(jié) 果

2.1酶切產(chǎn)物的判定 PAI-1基因PCR產(chǎn)物為142 bp經(jīng)BSⅡ酶切消化后產(chǎn)生不同的特異性片段，形成3種基因型：4G/4G基因型：只存在一個(gè)基因酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生96 bp和46 bp 2條帶；5G/5G基因型：存在2個(gè)酶切點(diǎn)，產(chǎn)生74 bp、46 bp和22 bp 3條帶；4G/5G基因型：同時(shí)具有96 bp、74 bp、46 bp和22 bp 4條帶。其中22 bp條帶在10% PAG膠電泳中跑出，見(jiàn)圖1。

FⅦ基因PCR產(chǎn)物為312 bp經(jīng)MspⅠ酶切消化后產(chǎn)生不同的特異性片段，形成3種基因型： RR基因型產(chǎn)生 206 bp、67 bp和39 bp三種片段，RQ基因型產(chǎn)生 273 bp、206 bp、67 bp和39 bp四種片段，QQ基因型有273 bp和39 bp兩種片段，見(jiàn)圖2。

2.2PAI-1基因型和等位基因頻率分布 如表1所示，4G/4G、4G/5G、5G/5G三種基因型和等位基因頻率病例和對(duì)照組間無(wú)顯著差異(χ2=4.52，P=0.11；χ2=2.17，P=0.14)；相比與含有5G等位基因的基因型，4G/4G基因型分布在病例和對(duì)照組間有顯著差異(χ2=4.05，P=0.44)。

1～8：5G/5G，4G/5G，5G/5G，4G/5G，4G/4G，4G/4G，4G/4G，5G/5G

1～9：RR，PQ，RR，RR，RQ，QQ，RR，QQ，RR，RR

表1PAI-1基因型和等位基因頻率分布〔n(%)〕

組別n基因型5G/5G4G/5G4G/4Gχ2值P值5G/5G+4G/5G4G/4Gχ2值P值等位基因頻率(%)5G4Gχ2值P值CHD組14632(21.9)68(46.6)46(31.5)4.5190.114100(68.5)46(31.5)4.0540.04445.254.82.1660.141對(duì)照組11333(29.2)57(50.4)23(20.4)90(79.6)23(20.4)54.445.6

2.3PAI-1基因型與CHD 與5G/5G相比，4G/5G，4G/4G的OR隨4G等位基因的增加呈增加趨勢(shì)，并且與含5G等位基因的基因型相比，4G/4G基因型與冠心病的病因關(guān)聯(lián)指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04)，提示4G/4G基因型與冠心病的危險(xiǎn)性相關(guān)(P<0.05)。4G/4G基因型的OR值為2.06，即表明具有4G/4G基因型比具有5G/5G基因型的人患冠心病的危險(xiǎn)性增加2.06倍(95%CI：1.03～4.14)，見(jiàn)表2。

2.4FⅦ基因型與CHD FⅦ基因型分布病例組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，本實(shí)驗(yàn)QQ基因型較少，結(jié)合QQ+PQ基因型頻率與RR型相比，F(xiàn)Ⅶ基因型分布病例組與對(duì)照組相比亦無(wú)顯著差異(P>0.05)。上述各組R、Q等位基因頻率相比，CHD組與對(duì)照組亦無(wú)顯著差異(P均>0.05)。見(jiàn)表3。用Logistic回歸分析FⅦ基因型與CHD危險(xiǎn)性間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，盡管Q等位基因有使得CHD患病降低的趨勢(shì)但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(β=-0.204，SE=0.407，P=0.617，95%CI=0.37～1.81)。

表2 PAI-1基因型與CHD危險(xiǎn)性的關(guān)系

表3 FⅦ基因型與等位基因頻率分布〔n(%)〕

3 討 論

目前CHD被認(rèn)為是多種遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的復(fù)雜的多基因遺傳病。國(guó)外資料顯示，PAI-1基因主要有三種多態(tài)性與血管病變有關(guān)：4G/5G插入或缺失多態(tài)性、二核苷酸(C-A)n重復(fù)序列多態(tài)性、HindⅢ限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，目前國(guó)外心血管領(lǐng)域以4G/5G插入或缺失多態(tài)性研究較多〔4～6〕。經(jīng)過(guò)對(duì)本研究人群資料的計(jì)算，正常人、CHD組PAI-1基因型頻率分布均符合HarDY-Weinberg平衡〔7，8〕，說(shuō)明本研究人群具有群體代表性，不存在選擇偏倚。本研究與Mansfield等〔9〕研究結(jié)果一致，其作用的機(jī)制可能4G/4G基因型顯著影響PAI-1的活性，血漿PAI-1活性增高引起纖溶活性降低,導(dǎo)致纖維蛋白清除減少,引起纖維蛋白沉積;同時(shí),PAI-1抑制血管外基質(zhì)的水解,限制血管外平滑肌遷移;另外,纖維蛋白與血管壁結(jié)合,通過(guò)刺激平滑肌細(xì)胞增殖而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的生長(zhǎng)。廣泛動(dòng)脈粥樣硬化引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致PA合成能力降低，儲(chǔ)存、釋放減少；內(nèi)皮細(xì)胞受損后，血管平滑肌細(xì)胞浸潤(rùn)、增生、合成和分泌大量的PAI-1；激活的血小板釋放大量的PAI-1進(jìn)一步抑制了PA，血中PAI-1增多；PA減少，PAI-1的增多，血液運(yùn)輸功能下降，加重內(nèi)皮損傷，形成惡性循環(huán)。另外本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)基因型與心肌梗死的關(guān)系，雖然4G/4G基因型相比與非4G/4G型(4G/5G+5G/5G)，有使心肌梗死發(fā)病升高的趨勢(shì)，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Eriksson等〔10〕研究結(jié)果不相符。此外PAI-1基因4G/5G多態(tài)性與冠脈病變程度，以及冠脈支架術(shù)后在狹窄率的關(guān)系如何需進(jìn)一步研究明確。本研究將RQ和QQ聯(lián)合分析，與RR基因型相比，RQ+QQ型有使冠心病，心肌梗死發(fā)病危險(xiǎn)性降低的趨勢(shì)，但都未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果的得出可能與種族有關(guān)。

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