周小莉 茍曉燕 李榮亨

(重慶市中醫(yī)院風(fēng)濕病科，重慶 400021)

研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮(NO)參與介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡在關(guān)節(jié)軟骨退行性改變過程中起著重要作用〔1，2〕。復(fù)元膠囊是臨床上長期用于治療骨關(guān)節(jié)炎(OA)療效有明顯的中藥復(fù)方實(shí)驗(yàn)制劑，本實(shí)驗(yàn)觀察復(fù)元膠囊對(duì)OA模型大鼠軟骨細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)液中NO及軟骨細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物 復(fù)元膠囊由人參、淫羊藿、鹿茸、黃芪、川芎、當(dāng)歸、枸杞子等組成，委托重慶希爾安藥業(yè)有限責(zé)任公司制成膠囊，僅供實(shí)驗(yàn)使用(醫(yī)院制劑批號(hào)：[2005]12號(hào)B-55)；壯骨關(guān)節(jié)丸，由深圳三九醫(yī)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：Z44023377。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性成年SD大鼠48只200～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(渝)2002007。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 TUNEL試劑盒購自美國Roche公司；硝酸還原酶法NO檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；蛋白酶K購自美國Sigma公司；DAB顯色試劑盒購自北京金橋中衫生物技術(shù)有限責(zé)任公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；兩步法RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；PCNA及內(nèi)參GAPDH引物購自上海Sangon公司引物序列為：DL2000型DNA Maker購自TaKaRa公司；DEPC水購自sigma公司；瓊脂糖粉購自北京金橋中衫生物技術(shù)有限責(zé)任公司；GoldViewTM核酸染料購自北京賽百盛公司。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器 RD2000型X線機(jī)：美國長青公司；BX-50行生物顯微鏡：日本Olympus公司；HITACHI-7500型透射電鏡：日本HITACHI公司；BX40型光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；ELX-800型酶標(biāo)儀： 德國Eppendorf公司；PCR 儀：德國EPPENDORF公司；Bio-RAD電泳儀及凝膠成像儀：美國BioRad公司。PCNA(290 bp)正向：5' TTGGAATCCCAGAACAGG3'；反向5'AGACAGTGGAGTGGCTTT3'；GAPDH(492 bp)正向：5'ATCACTGCCACCCAGAAGACT3'；反向5'CATGCCAGAGGTCGGTTCGTTTT3'。

1.5方法

1.5.1動(dòng)物分組 48只SD大鼠隨機(jī)分成四組，分別為正常組、模型組、壯骨關(guān)節(jié)丸組以及復(fù)元膠囊組，每組12只。

1.5.2建立動(dòng)物模型 除正常組外，其余各組參照Hulth造模型方法〔3〕。0.5%的水合氯醛按0.35 g/100 g腹腔注射麻醉大鼠，在無菌條件下切斷右膝內(nèi)側(cè)副韌帶、切除內(nèi)側(cè)半月板以及剪斷前交叉韌帶，逐層縫合，無菌包扎。術(shù)后每天肌注青霉素2×104U/kg，共3 d。1 w后，每天驅(qū)趕大鼠跑步30 min。

1.5.3給藥 根據(jù)Meeh-Rubner公式〔4〕計(jì)算大鼠的給藥劑量。手術(shù)后第4周，復(fù)元膠囊組給予復(fù)元膠囊0.72 g·kg-1·d-1(相當(dāng)生藥5.76 g·kg-1·d-1)、壯骨關(guān)節(jié)丸組給予壯骨關(guān)節(jié)丸1.14 g·kg-1·d-1配制成3 ml溶液，正常組、模型組分別給予生理鹽水3 ml，每天灌胃1次，共8 w。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1大體肉眼觀察 大鼠抽取血液及關(guān)節(jié)炎液后處死，肉眼觀察膝關(guān)節(jié)有無滑膜腫脹，并于解剖顯微鏡下觀察股骨內(nèi)髁、內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面的病理改變。

1.6.2光鏡觀察軟骨細(xì)胞及基質(zhì) 取股骨內(nèi)髁全層軟骨標(biāo)本置于4%中性緩沖甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色。觀察軟骨組織的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量和潮線的完整性，根據(jù)Mankin法進(jìn)行評(píng)分。

1.6.3電鏡觀察軟骨細(xì)胞及基質(zhì) 銳利刀片切取1 cm3大小股骨內(nèi)髁損傷部位全層軟骨，立即放人4 ℃的2.5%戊二醛中固定2 h。10%EDTA脫鈣3 w，1%鋨酸固定2 h，4 ℃冰箱內(nèi)用乙醇逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片50～60 μm，電子染色，并在HITACHI-7500型透射電鏡下觀察。

1.6.4TUNEL法檢測軟骨細(xì)胞凋亡 參照Roche公司TUNEL試劑說明書操作，并設(shè)立陰性對(duì)照。陽性判定：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每張切片任取5個(gè)視野，高倍鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI) =TUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)/軟骨細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.5硝酸還原酶法檢測關(guān)節(jié)液中NO活性 按照NO測定試劑盒說明書要求設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)管和空白管，空白管調(diào)零，紫外分光光度計(jì)在530 nm波長下測定吸光度值(A)。

1.6.6RT-PCR法檢測PCNA mRNA表達(dá) 用Trizol提取各組軟骨的總RNA。各組取1 μl總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積10 μl(含MgC 12 2 μl、10×RT緩沖液1 μl、 RNase Free dH2O 3.75 μl、dNTP混合物1 μl、RNase抑制劑0.25 μl、轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl、Oligo酶0.5 μl)。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3 μl進(jìn)行PCR循環(huán)(94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)，末次延伸10 min,4 ℃保存)。反應(yīng)完畢，取反應(yīng)產(chǎn)物10 μl于1.5%含50 μl/L GoldViewTM核酸染料瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，BIO-RAD凝膠成像儀中紫外光下觀察拍照，用Quantity One凝膠圖像分析軟件檢測各組目的基因及其GAPDH基因的光密度值，計(jì)算二者的比值，作為各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大體形態(tài)觀察 正常組大鼠關(guān)節(jié)軟骨外觀呈藍(lán)白色，表面光滑，色澤明亮潤澤，無裂紋及軟化，滑膜未充血增生，關(guān)節(jié)液清亮。模型組軟骨表面極不光滑，色澤晦暗，局部軟骨有缺損，甚至有潰瘍出現(xiàn)，深者可達(dá)骨質(zhì)，軟骨下骨暴露，軟骨邊緣有較多骨贅形成，滑膜充血增生，關(guān)節(jié)液渾濁。復(fù)元膠囊組和壯骨關(guān)節(jié)丸組滑膜有明顯增生，脛骨平臺(tái)變淺，軟骨表面不太規(guī)則，部分軟骨有裂紋，甚至有細(xì)小潰瘍出現(xiàn)，壯骨關(guān)節(jié)丸組出現(xiàn)上述改變的程度大于復(fù)元膠囊組。

2.2各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)觀察 軟骨表面連續(xù)性好，層次清晰，潮線完整，細(xì)胞排列整齊，分布均勻。模型組軟骨表層有明顯凹陷，結(jié)構(gòu)難以分辨，嚴(yán)重的表層消失，部分區(qū)域呈絨毛狀，可見較多裂隙從表層軟骨延伸向下深達(dá)輻射層，裂隙中可見稀疏結(jié)締組織及松散的網(wǎng)狀連接，有纖維充填，潮線消失。壯骨關(guān)節(jié)丸組軟骨裂隙深達(dá)軟骨下骨，細(xì)胞排列紊亂，表層細(xì)胞數(shù)量減少，中深層可見細(xì)胞簇集成團(tuán)，潮線消失。復(fù)元膠囊組軟骨4層界限欠清楚，在表層的凹陷中有軟骨細(xì)胞充填，周圍細(xì)胞有簇集現(xiàn)象，潮線多數(shù)不完整。模型組軟骨Mankin評(píng)分明顯高于正常組，復(fù)元膠囊組軟骨Mankin評(píng)分明顯低于模型組(P<0.01),復(fù)元膠囊組軟骨Mankin評(píng)分比壯骨關(guān)節(jié)丸組低(P< 0.05)。見表1。

2.3透射電鏡下觀察軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 正常組軟骨細(xì)胞核完整，核膜清晰，核內(nèi)染色體均勻分布，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈層狀排列，線粒體散在分布、細(xì)胞表面有許多微絨毛突起。凋亡細(xì)胞體積明顯縮小，突起消失。細(xì)胞從周圍軟骨基質(zhì)退縮，核膜發(fā)生皺褶，染色體濃集，胞質(zhì)密度增高,有典型的凋亡小體，內(nèi)有細(xì)胞器,細(xì)胞周圍可見脫落的凋亡小體。

2.4TUNEL法檢測軟骨細(xì)胞凋亡情況 凋亡的軟骨細(xì)胞核呈棕黃色，主要分布在軟骨的淺層和中層。正常軟骨中有弱陽性表達(dá)，主要位于軟骨表層；模型組軟骨的移行層和深層有陽性細(xì)胞表達(dá)，AI明顯高于正常組。壯骨關(guān)節(jié)丸組和復(fù)元膠囊組在表層和移行層也有陽性細(xì)胞表達(dá)，但AI明顯低于模型組(P< 0.05)，而復(fù)元膠囊組和壯骨關(guān)節(jié)丸組比較差異顯著(P< 0.05)，見表1。

表1 復(fù)元膠囊對(duì)膝OA軟骨Mankin評(píng)分及AI的影響±s，n=12)

2.5復(fù)元膠囊對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中NO的影響 模型組、壯骨關(guān)節(jié)丸組和復(fù)元膠囊組關(guān)節(jié)液中NO濃度較正常組升高(P<0.01)，而壯骨關(guān)節(jié)丸組和復(fù)元膠囊組比模型組明顯降低(P<0.01)，復(fù)元膠囊組關(guān)節(jié)液中NO水平低于壯骨關(guān)節(jié)丸組(P<0.05)。見表2。

2.6復(fù)元膠囊對(duì)關(guān)節(jié)軟骨PCNA mRNA表達(dá)的影響 各組軟骨提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄并PCNA序列擴(kuò)增后，電泳顯示不同的熒光強(qiáng)度。造模后各組軟骨節(jié)軟骨PCNA mRNA表達(dá)代償性增加，復(fù)元膠囊組與壯關(guān)節(jié)丸組PCNA mRNA增加高于模型組(P<0.05)；復(fù)元膠囊組與壯骨關(guān)節(jié)丸組PCNA mRNA表達(dá)比較差異顯著(P<0.05)。見表2。

表2 復(fù)元膠囊對(duì)膝OA關(guān)節(jié)液中NO、軟骨細(xì)胞PCNA mRNA的影響±s，n=12)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)元膠囊能促進(jìn)離體軟骨細(xì)胞DNA及Ⅱ型膠原的合成〔5〕，同時(shí)，降低大鼠OA模型血清中軟骨代謝標(biāo)志物COMP水平，從而延緩骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變過程〔6〕。本研究從NO介導(dǎo)的凋亡及增殖角度研究復(fù)元膠囊治療OA的作用機(jī)制。

關(guān)節(jié)軟骨退行性改變是OA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，共同的病理學(xué)特征是關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性變性、破壞，軟骨下骨硬化，關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，骨贅形成〔7〕。通過比較復(fù)元膠囊組與模型組軟骨外觀大體觀察、組織學(xué)評(píng)分，我們可以看出復(fù)元膠囊對(duì)膝OA模型的軟骨退變有明顯的保護(hù)作用，延緩OA病程。

軟骨細(xì)胞過度凋亡在軟骨退行性改變過程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，透射電鏡下可觀察到典型的凋亡形態(tài),包括細(xì)胞體積縮小、染色質(zhì)凝聚、核碎片、細(xì)胞皺縮、凋亡小體等；細(xì)胞凋亡末端原位檢測(TUNEL)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Hulth法建立的OA動(dòng)物模型關(guān)節(jié)軟骨有凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)，主要位于淺層和中層，移行層和深層也有陽性細(xì)胞表達(dá)明顯，高于正常組，再次證明軟骨細(xì)胞凋亡參與了OA的病理改變。

軟骨細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有兩個(gè)獨(dú)立通路，一是NO依賴通路，二是Fas介導(dǎo)的非NO依賴通路，在OA中NO依賴通路更重要〔2〕，所以通過抑制NO的活性從而抑制細(xì)胞過度凋亡可能是一條治療OA的途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，造模后關(guān)節(jié)液中NO濃度顯著升高，復(fù)元膠囊能降低OA模型膝關(guān)節(jié)液中的NO濃度。而NO又是誘導(dǎo)凋亡的主要途徑之一，降低NO活性，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)了軟骨。因此復(fù)元膠囊能通過抑制NO途徑，從而抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。

軟骨細(xì)胞因過度凋亡，導(dǎo)致軟骨破壞，但同時(shí)也啟動(dòng)了機(jī)體的增殖，軟骨細(xì)胞通過增殖來代償，維持平衡狀態(tài)〔8〕。PCNA是從G1期后半至S期前半過程中細(xì)胞核內(nèi)急劇增多的一種核蛋白質(zhì)，目前認(rèn)為它的表達(dá)是衡量細(xì)胞增殖的重要標(biāo)記物〔9〕。OA患者損傷關(guān)節(jié)軟骨及負(fù)重區(qū)軟骨中的軟骨細(xì)胞數(shù)少于正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)，凋亡引起軟骨細(xì)胞數(shù)量減少伴有細(xì)胞代償性的增殖〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，造OA模型后軟骨細(xì)胞凋亡伴有軟骨PCNA mRNA表達(dá)代償性增加，體現(xiàn)了OA的發(fā)病是損傷與抗損傷相互作用的結(jié)果。復(fù)元膠囊能促進(jìn)軟骨PCNA mRNA的表達(dá)，提示復(fù)元膠囊可通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖而對(duì)OA軟骨起保護(hù)作用。

綜上，復(fù)元膠囊可以減輕骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的病理改變，降低軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)及關(guān)節(jié)液中NO水平，增加軟骨PCNA mRNA的表達(dá)，從而減緩骨關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)展。

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