曹東林，胡亮杉，林茂銳，王婷，黃基偉，田軍章

（廣東省第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東廣州510317）

探針熒光定量PCR在肺炎鏈球菌檢測中的應用

曹東林，胡亮杉，林茂銳，王婷，黃基偉，田軍章

（廣東省第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東廣州510317）

目的建立探針熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌的方法。方法針對肺炎鏈球菌種屬特異性基因lytA，設計合成了特異引物和探針，研究引物和探針的靈敏度和特異性，確定循環(huán)閾值(cycle threshold，ct）的臨界值(cut-off value）。將熒光定量PCR和細菌培養(yǎng)法進行比較，同時檢測158份肺炎患者痰液標本加以驗證。結(jié)果針對LytA基因所設計的引物和探針能靈敏地檢出常見致病的血清型肺炎鏈球菌株，檢測靈敏度為每個反應100個基因組DNA拷貝。通過熒光量PCR方法，35株肺炎鏈球菌中檢測結(jié)果為陽性有34株，檢測結(jié)果為陰性的有1株；15株非肺炎鏈球菌全部為陰性。通過熒光定量PCR方法，158份痰液標本中共檢測出34份肺炎鏈球菌陽性，其中10份培養(yǎng)出相應的病原菌。肺炎鏈球菌陽性患者的白細胞數(shù)量和住院時間均顯著高于陰性患者(P＜0.05）。肺炎鏈球菌陽性患者住院時間均顯著長于陰性患者(P＜0.05）。結(jié)論探針熒光定量PCR方法能特異地檢測肺炎鏈球菌，具有很高的靈敏度，能提高臨床肺炎鏈球菌感染患者標本的陽性檢出率。

肺炎鏈球菌；聚合酶鏈反應；熒光探針

國外的流行病學調(diào)查，美國每年有肺炎患者300～560萬，超過100萬人次住院，住院患者平均病死率為8.8～15.8%，重癥肺炎患者死亡率高達50%，居所有疾病死因的第6位，在英國每年有肺炎患者超過50萬，居死因第4位。由此可見，肺炎是威脅人類健康的常見病、多發(fā)病。然而國內(nèi)并無系統(tǒng)的全面的病原學調(diào)查資料，也缺乏對病原耐藥性現(xiàn)狀的監(jiān)測資料，初步統(tǒng)計我國每年有肺炎患者約450萬人［1-2］。目前，肺炎的常見病原體主要分為3類，包括細菌、病毒和非典型病原體。國外文獻報道，肺炎病原體仍以細菌為常見，其中肺炎鏈球菌又最為常見，約占細菌性肺炎的1/2，其次為流感嗜血桿菌等，肺炎支原體等非典型病原亦占重要地位［3-4］。

細菌培養(yǎng)和普通PCR的方法已用于可疑臨床病例標本中肺炎鏈球菌的檢測和病例的輔助診斷，但抗生素的廣泛使用使細菌培養(yǎng)非常困難。因此，目前我國肺炎病例的診斷多為臨床診斷，缺乏病原學檢測結(jié)果。最近幾年來，熒光定量PCR技術(shù)因其高靈敏度、高特異性以及耗時短的特點，得到廣泛應用［5-6］。本研究擬建立探針熒光定量PCR方法檢測肺炎患者標本的方法，提高肺炎病原體肺炎鏈球菌檢測陽性率。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 Vitek-32全自動細菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司）、熒光定量試劑盒（上海英俊公司）：分光光度計（Eppendorf公司，德國）；PCR儀（應用生物信息公司，美國）：CEQw8000測序儀（Beckman CouLter公司，美國）：酶標儀（TECAN公司，瑞士）；T4 DNA連接酶、pMDl8-T載體（TaKaRa公司，日本）：dATP、dTTP、dCTP、dGTP（寶生物公司，大連）；DTCS Quick Start測序試劑盒（Beckman CouLter公司，美國）。

1.2 菌株和標本來源 本實驗所用50株菌株來廣東省第二人民醫(yī)院檢驗科分離的的臨床株，其中35株為肺炎鏈球菌，15株為非肺炎鏈球菌（大腸桿菌、奇異變性桿菌、產(chǎn)酸桿菌、肺炎克雷伯菌、黏質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌、不動桿菌、黃桿菌、副流感嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌各1株）；158份痰液標本為本院臨床診斷為肺炎的住院患者的痰液標本。

1.3 實驗方法

①引物：在NCBI網(wǎng)站中根據(jù)肺炎鏈球菌種屬特異性蛋白的lytA基因（登錄號NC_003098）設計引物和探針。上游引物為5'GTCAACGTGGTCTGAGTGGT 3'，下游引物為5'AGATGAAGCAGGTTTGCCGA 3'，探針引物為Cy5-5'CGCTTGATACAGGGAGTTTAG 3'-BHQ。引物和探針委托上海英俊公司合成。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒的說明書對目的基因進行擴增檢測。

②質(zhì)粒標準品：為含PCR擴增序列（109 bp）的重組PMD-18T質(zhì)粒（TAKARA公司）載體。用eppendorf紫外分光光度計定量重組質(zhì)粒的濃度及A260/A280比值。

③將肺炎鏈球菌接種于血平板（法國生物梅里埃公司），5% CO2、37℃培養(yǎng)18～20 h。肺炎鏈球菌菌株采用革蘭染色鏡檢、Optochin和膽汁溶解試驗進行鑒定。

④收集新鮮培養(yǎng)的菌株，Qiagen試劑盒提取菌株DNA。痰液標本的處理按照Qiagen試劑盒操作說明書進行，從200μL痰液中提取DNA，100μL AE緩沖液中洗脫。

⑤每個PCR反應體系總體積為20μL，其中含2×PCR反應混合物10μL，上下游引物、探針各2μL（終濃度在優(yōu)化過程中進行調(diào)整），參比熒光Rox 0.3μL，DNA模板2μL，超純水1.7 μL。PCR反應條件為：50℃2min；95℃5min；95℃15 s.60℃30 s，共50個循環(huán)。每次擴增均以肺炎鏈球菌全基因組DNA為陽性對照，超純水為陰性對照；所有相同的樣品和陰陽性對照都設有2個復孔以進行平行檢測。擴增反應的循環(huán)閾值（Ct）通過儀器自帶軟件進行計算。

⑥基因的上、下游引物反應終濃度分別采用100、200、400和800 nmoL/L，探針終濃度分別采用50 nmoL/L和100 nmo/L，檢測相應的陽性對照DNA濃度為20 ng/μL。分析比較各種濃度組合下的擴增曲線和Ct值，選取最優(yōu)濃度。

⑦特異性檢測：用lytA引物和探針檢測本實驗臨床分離鑒定的50株菌株。

⑧用eppendorf紫外分光光度計測定參考菌株DNA濃度并調(diào)整至1 ng/μL，用超純水10倍系列稀釋，使其終濃度為1 ng/ μL～1 fg/μL，用熒光定量PCR進行檢測。以雙孔均有陽性擴增曲線且Ct值一致的最小DNA濃度為引物和探針的最低檢測限，并將該Ct值作為下一步臨床標本檢測中Ct值的cut off值。

⑨用細菌培養(yǎng)和熒光定量PCR方法同時檢測臨床痰液標本158份。熒光定量PCR檢測Ct值小于相應的cut-off值者定為陽性反應。

2 結(jié)果

2.1 標準品的制備 根據(jù)熒光PCR擴增片段涉及合成的質(zhì)粒DNA標準品經(jīng)測序，證明序列目的序列，可以用作肺炎鏈球菌的DNA標準曲線的制備以及DNA拷貝數(shù)的計算，如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒DNA標準品的測序圖Fig.1 Sequence of Plasmid DNA

2.2 檢測體系的靈敏度 采用本研究設計的熒光定量PCR檢測引物對合成的質(zhì)粒標準品DNA進行檢測，結(jié)果顯示，該檢測體系的檢測靈敏度為1.0×102拷貝。設定1.0×102拷貝為檢測閾值的臨界值（cut-off值），標準曲線如圖2所示。

圖2 DNA拷貝數(shù)與循環(huán)次數(shù)的線性關系Fig.2 Liner relationship with DNA copies and cycles

2.3 檢測體系的特異性 采用本檢測體系對本科分離的50株菌株進行測定，結(jié)果顯示，35株肺炎鏈球菌中檢測結(jié)果為陽性的有34株，檢測結(jié)果為陰性的有1株；15株非肺炎鏈球菌全部為陰性，說明本檢測體系具有很高的特異性，如表1所示。

表1 50株菌株DNA的熒光定量PCR擴增結(jié)果（株）Tab.1 Results of real-time fluorescence quantitative PCR（strains）

2.4 對臨床痰液標本的檢測 利用本檢測體系對本院收集的158份痰液標本進行檢測，共檢測出34份肺炎鏈球菌陽性標本，其中10份培養(yǎng)出相應的病原菌。采用熒光PCR檢測時肺炎鏈球菌的陽性率為21.5%，而采用細菌培養(yǎng)法時肺炎鏈球菌的陽性率為6.3%，前者顯著高于后者，見表2。

表2 熒光PCR與細菌培養(yǎng)法檢測肺炎鏈球菌的比較Tab.2 Comparisons of real-time fluorescence quantitative PCR with culture

2.5 熒光PCR檢測肺炎鏈球菌陽性患者白細胞數(shù)量及住院時間的變化 將熒光PCR檢測肺炎鏈球菌陽性患者與陰性患者的白細胞數(shù)量和住院時間進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌陽性患者的白細胞數(shù)量和住院時間均顯著高于陰性患者（P＜0.05，見表3）。

表3 熒光定量PCR檢測結(jié)果與患者白細胞數(shù)及住院時間比較Tab.3 Comparisons of real-time fluorescence quantitative PCR with white blood cells count and time in hospital of patients

3 討論

近年來，國內(nèi)外學者對引起肺炎的病原體進行了大量的研究［7-8］。以前認為肺炎的病原體相對比較簡單，近年來隨著實驗室診斷方法的不斷進步，各種高靈敏的免疫檢測方法和聚合酶鏈式反應（PCR）核酸檢測方法先后進入臨床檢測，使得各種病原體的檢出率明顯增加，但在國家食品藥品監(jiān)督管理局的官方網(wǎng)站上還沒有經(jīng)批準用于臨床的肺炎鏈球菌熒光PCR檢測試劑盒。

目前，肺炎病原學檢測主要有包括：呼吸道標本細菌培養(yǎng)、血培養(yǎng)、血清學檢測、免疫層析法以及最近開展的PCR技術(shù)，作為一個及時和準確的檢測方法，熒光定量PCR方法能夠幫助區(qū)分呼吸道標本中是否有細菌的繁殖，并且可以通過標準曲線獲得感染細菌的起始模板的數(shù)量，從而確定細菌感染量，為臨床指導用藥提供重要的實驗依據(jù)。LytA基因編碼的是肺炎鏈球菌的自溶酶，是肺炎鏈球菌致病性所必需的［9］。本研究中，根據(jù)NCBI的網(wǎng)絡數(shù)據(jù)設計合成了針對肺炎鏈球菌LytA基因的特異性引物和熒光探針，利用質(zhì)粒構(gòu)建了PCR檢測的DNA標準品。實驗證明，所建立的檢測方法的靈敏度為1.0×102拷貝，特異性非常高，35株肺炎鏈球菌中檢測結(jié)果為陽性的有34株，檢測結(jié)果為陰性的只有1株，15株非肺炎鏈球菌全部為陰性，能夠滿足臨床的需要。采用熒光定量PCR方法對臨床158例肺炎患者的痰標本進行檢測，共檢測出肺炎鏈球菌34例，而細菌培養(yǎng)方法只能檢出10例，熒光定量PCR方法的陽性檢出率顯著高于細菌培養(yǎng)法，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。將熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌陽性患者與陰性患者的白細胞數(shù)量和住院時間進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌陽性患者的白細胞數(shù)量和住院時間均顯著高于陰性患者（P＜0.05），此結(jié)果提示，肺炎鏈球菌陽性對于疾病的轉(zhuǎn)歸是一個不利因素，及時使用抗生素控制肺炎鏈球菌感染將會縮短住院時間，對患者有利。本研究結(jié)果說明，設計的用于檢測肺炎鏈球菌的探針熒光定量PCR檢測方法能夠顯著提高肺炎鏈球菌的陽性檢出率，特異性高，可為臨床合理使用抗生素及時提供實驗依據(jù)。肺炎的病原體究竟有多少種還不得而知，下一步將根據(jù)臨床需要建立一種能夠同時檢測2種或2種以上病原體的探針熒光定量PCR檢測方法，為臨床用藥提供更加詳實的數(shù)據(jù)信息。

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（編校：譚玲）

Clinical application of real-time fluorescence quantitive PCR for detecting Streptococcus pneumoniae

CAO Dong-lin，HU Liang-shan，LIN Mao-rui，WANG Ting，HUANG Ji-wei，TIAN Jun-zhang

（Department of Laboratory Medicine，The Second Provincial People's Hospital of Guangdong，Guangzhou 510317，China）

ObjectiveTo establish an assay for the detection of Streptococcus pneumoniae by real-time fluorescence quantititive polymerase chain reaction（PCR）.MethodsSpecial primers and probe for the autolysin A（lytA）gene were designed.The sensitivity and specificity of primers and probewere studied，and cut-off of cycle threshold was assayed.158 clinical specimenswere confirmed by real-time fluorescence quantitative PCR and bacterial culturemethod.ResultsPrimer and probe design for LytA gene could sensitively detect serotype Streptococcus pneumoniae strains of common pathogenic，and the sensitivity was 100 copies.Among 35 strains of Streptococcus pneumoniae，34 caseswere detected to be positive for Streptococcus pneumoniae by real-time fluorescence quantitative PCR，while 1 case was detected to be negative；among 15 strains of non-Streptococcus pneumoniae，allwere detected to be negative.Among the 158 clinical sputum specimens，34 cases with Streptococcus pneumoniae were detected by real-time fluorescence quantitative PCR，while only 10 cases with Streptococcus pneumoniae were detected by the culturemethod.White blood cells count and time in hospital of cases with Streptococcus pneumoniae were higher than those of cases without Streptococcus pneumoniae（P＜0.05）.ConclusionReal-time fluorescence quantitative PCR is a sensitive and specific assay for the detection of Streptococcus pneumoniae.It can be used for the diagnosis of Streptococcus pneumoniae.

Streptococcus pneumoniae；real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction；fluorescence probe

R446

A

1005-1678(2014）07-0102-03

廣東省醫(yī)學科學技術(shù)研究基金（C2012036）；廣州市科技計劃基金項目（應用基礎）（2013J4100007）；2013年度廣東省級財政技術(shù)研究開發(fā)與推廣應用專項資金項目（粵財工［2013］401號）

曹東林，男，博士，副教授，研究方向：臨床生化檢驗技術(shù)、臨床免疫檢測技術(shù)、病原體快速檢測技術(shù)等，E-mail：drcaodonglin@126.com；田軍章，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：緊急醫(yī)學救援，E-mail：jz.tian @163.com。