李素芬，郭尚敬

（1.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城252000；2.聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城252000）

全人源藥用抗EGFR ScFv（HL-L-L）的構(gòu)建、表達及抗腫瘤活性分析

李素芬1，郭尚敬2Δ

（1.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城252000；2.聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城252000）

目的對抗EGFR單克隆抗體重鏈可變區(qū)(VH）和輕鏈全長(L）經(jīng)柔性肽鏈(linker）連接而成的單鏈抗體(VH-L-L）進行構(gòu)建、表達及其抗腫瘤活性的分析，并對其進行生物信息學(xué)分析和相關(guān)譜學(xué)表征。方法通過OVER LAPING技術(shù)得到EGFR ScFv (HL-L-L）基因，然后構(gòu)建原核表達載體pET-28a-c(+）-VH-L-L，經(jīng)誘導(dǎo)表達、Ni柱純化后得到目的蛋白HL-L-L，并對其利用SWISSMODEL進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；通過紫外掃描分光光度計，進行吸收波長的掃描；用NanoZSP表征目的蛋白VH-L-L的粒度和電位；隨后利用藥理學(xué)方法，研究HL-L-L對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制情況。結(jié)果成功構(gòu)建了原核表達載體pET-28a-c(+）-VH-L-L；獲得了較高純度的VH-L-L蛋白，并成功預(yù)測了其三維結(jié)構(gòu)；其粒度約為489.7 nm，Zeta電勢為-38.1，帶負(fù)電；HL-L-L對MCF-7具有一定的增殖抑制作用，與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01）。結(jié)論成功表達了全人源藥用抗EGFR ScFv(HL-L-L），其對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用顯著，為下一步研制抗EGFR的小分子抗體藥物提供基礎(chǔ)。

全人源；EGFR；ScFv；抗腫瘤

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是腫瘤治療中一個很重要的靶分子，針對EGFR靶點的單鏈抗體藥物的研究具有廣闊的前景。EGFR是一種廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上的多功能糖蛋白，與HER2/ErbB-2、HER3/ErbB-3和HER4/ErbB-4被歸入HER/ErbB家族，同屬于受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs）［1］。EGFR及其配體的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在腫瘤形成和發(fā)展過程中起重要作用。EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中EGFR基因、配體以及下游的KRAS，BRAF和PIK3CA基因一直都是研究的熱點［2］。EGFR表達異?？梢詫?dǎo)致細(xì)胞信號通路持續(xù)活化、細(xì)胞無限制生長轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞增殖分裂，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和進展［3］。針對EGFR的單克隆抗體已經(jīng)應(yīng)用于臨床，如西妥昔單抗［4］和尼妥珠單抗［5］。但是單克隆抗體存在分子量大，免疫原性強等缺點［6］。自從1988年Bird和Huston成功研制了第一個單鏈抗體以來，目前己研制成功并生產(chǎn)了多種單鏈抗體，除應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和疾病的體外診斷外，有一些已開始應(yīng)用于臨床治療［7］。單鏈抗體（single-chain Fv，ScFv）是利用基因工程技術(shù)將免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過一段肽鏈連接成重組蛋白而得到的小分子抗體片段，其免疫原性較小，已逐漸成為抗體靶向治療的重要研究方向［8］。已有對EGFR單鏈抗體的的研究大都是非人源的，且是還沒成藥的ScFv。本實驗中為全人源藥用抗EGFR ScFv（HL-L-L），且全人源抗EGFR單克隆抗體已上市，本實驗旨在構(gòu)建VH、L基因源于已成藥的全人源抗EGFR單克隆抗體基因，以期把科研與生產(chǎn)相結(jié)合，為以后全人源藥用抗EGFR ScFv（HL-L-L）的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 BL21DE3為本實驗室保存；癌細(xì)胞為第二軍醫(yī)大學(xué)腫瘤所贈與；大腸桿菌DH5α菌株，pET-28a-c（+）（Novagen公司）；2×Taq PCR Master Mix（TIAN GEN生物公司）；DL1000（Takara公司）；PfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（賽默飛公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒（OMEGA公司）；細(xì)菌蛋白抽提試劑盒CW0888、NI-Agaros His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）CW0894（康為世紀(jì)）；protein Ladder（Thermo公司）；引物由生工生物工程有限公司合成；EGFR重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈全長（L）序列由上海張江生物技術(shù)有限公司提供；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器 Nano Series Nano ZS90型粒度測定儀（英國馬爾文儀器有限公司）；5427R冷凍離心離心機（eppendorf公司）；HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱（賽默飛公司）；0.5 mL10K超濾離心管（Millipore公司）；Cary100紫外可見分光光度計（Agilent公司）；酶標(biāo)儀680（Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 VH-L-L單鏈抗體的基因構(gòu)建：根據(jù)上海張江生物技術(shù)有限公司提供的VH和L的已知基因序列的N端及C端序列，設(shè)計構(gòu)建VH-L-L的引物序列，并通過OVER LAPPCR技術(shù)，引入連接肽，把VH與L序列通過連接肽拼接獲得1176bp的LL-VH。VH的上游引物為：5′-tcc CCATGG CC ATGCACCATCATCATCATCATATGGATTTTCAGGTGCAGAT-3′；VH的下游引物序列為：5′-ACTCCCGCCTCCACCGCTACCACCCCCTCCAGATCCGCCACCTCCTGAAGAGACGGTGACCATTG-3′；L的上游引物為：5′-GGAGGTGGCGGATCTGGAGGGGGTGGTAGCGGTGGAGGCGGGAGTATGGATTTTCAGGTGCAGAT-3′；L的下游引物為；5′-tccCTCGAGCTATTATCA ACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3′。其中加黑框的分別為NcoI、XhoI酶切位點；標(biāo)有下劃線部分為連接肽，為構(gòu)建VH-L-L而設(shè)計。

PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃1min，60℃50s，72℃2 min，30個循環(huán)；然后72℃10min。獲得VH-L和L-L基因產(chǎn)物。將產(chǎn)物進行電泳檢測并用膠回收試劑盒回收，通過OVER LAP PCR構(gòu)建VH-L-L基因。在反應(yīng)體系中只加入緩沖液、DNA聚合酶和上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，首先以94℃2min，58℃1min，72℃1min的PCR反應(yīng)程序進行10個循環(huán)。然后向上述反應(yīng)體系中加入VH上游引物和L下游引物，再以下述反應(yīng)體系進行反應(yīng)：94℃5min；94℃1min，60℃50s，72℃1min，進行30個循環(huán)；然后以72℃延伸10min。最后得到VH-L-L基因序列。

1.3.2 構(gòu)建PET30A-VH-L-L重組原核表達載體：用NcoI、XhoI分別消化原核表達載體PET28A與VH-L-L基因序列，純化回收后按1：10（摩爾濃度）的比例混合，用DNA連接酶進行連接，獲得pET-28a-c（+）-VH-L-L重組原核表達載體。

1.3.3 VH-L-L蛋白的誘導(dǎo)表達及分離純化：將pET-28a-c（+）-VH-L-L轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)，在含卡納的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再經(jīng)篩選、雙酶切鑒定、測序鑒定。獲得陽性克隆并擴大培養(yǎng)。提取pET-28a-c（+）-VH-L-L質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化BL21DE3感受態(tài)，經(jīng)篩選、酶切、測序鑒定獲得含有pET-28a-c（+）-VH-L-L的BL21DE3的陽性克隆。然后37℃培養(yǎng)該陽性克隆。當(dāng)A600約為0.6時，加入終濃度為0.6mmol/L的IPTG，然后進行12 h的誘導(dǎo)表達。按照細(xì)菌蛋白抽提試劑盒說明書進行細(xì)菌可溶性蛋白的抽提，獲得細(xì)菌可溶性蛋白。然后用12%的SDS-PAGE檢測目的蛋白VH-L-L的表達情況。按照NI-Agaros His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書對細(xì)菌可溶性蛋白進行VH-L-L蛋白的分離純化。將純化后的蛋白放于-4℃保存。然后用15%的SDS-PAGE檢測目的蛋白VH-L-L的純化情況。

1.3.4 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測：生物信息學(xué)是以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的交叉學(xué)科，利用生物信息學(xué)方法推算出來的結(jié)果已經(jīng)成為生物學(xué)研究的重要輔助手段［9］。利用軟件SWISS—MODEL（http：//swissmodel.expasy./）進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測［10］，利用該服務(wù)器提供的First approach mode（簡捷模式）［11］建立VH-L-VL蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。

1.3.5 用NanoZSP表征目的蛋白VH-L-L的粒徑分布情況：對樣品進行稀釋后檢測。分別在1mL水中加10μL洗脫緩沖液，和在1mL水中加了10μL溶有HL-L-L的洗脫緩沖液。分別混勻，上機檢測。

1.3.6 用NanoZSP表征目的蛋白VH-L-L的電位（zeta potential distribution）：對樣品進行稀釋后檢測。分別在1 mL水中加10μL洗脫緩沖液，和在1mL水中加10μL溶有HL-L-L的洗脫緩沖液。分別混勻，上機檢測。

1.3.7 用VH-L-L對體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞處理：參照劉文哲［12］等介紹的方法復(fù)蘇MCF-7癌細(xì)胞，取對數(shù)生長期的MCF-7癌細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶液消化，用PBS液洗滌2次，離心后吸棄上清液，用4mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，稀釋分別以1×104/孔、1×104/孔和1×105/孔接種于96孔板，不同細(xì)胞濃度每種鋪5孔。待細(xì)胞豐度達到70%～80%時，按梯度加VH-L-L（終濃度按體積百分比）：2%、4%、6%、8%、10%，并設(shè)立空白對照，各3個重復(fù)。待24h后，去舊培養(yǎng)基，加10%的CCK-8培養(yǎng)基孵育2 h，用酶標(biāo)儀進行檢測，測量波長是450 nm，參比波長650 nm。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用Excel、SPSS18.0統(tǒng)計軟件、制圖origin軟件和Excel對實驗數(shù)據(jù)進行整理分析。正態(tài)計量資料用“±s”表示，組間比較用方差分析和t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單鏈抗體VH-L-L的構(gòu)建 本實驗所用單鏈抗體VHL-L的VH基因片段為423 bp。L片段為726 bp，VH-L-L的N端加上起始密碼子和組氨酸標(biāo)簽，并采用45 bp的Linker序列（GGA GGTGGC GGA TCT GGA GGG GGT GGT AGC GGT GGA GGCGGG AGT）將VH與L連接成VH-L-L，該擬構(gòu)建的基因片段序列共1206bp（見圖1）。

圖1 VH-L-L序列圖Fig.1 Sequences of VH-L-LA.核苷酸序列；B.氨基酸序列；其中，*表示終止密碼子A.Nucleotide sequence；B.Amino acid sequence；*indicates stop codon

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pET-28a-c（+）-VH-L-L（6437bp）經(jīng)NcoI和XhoI酶切后出現(xiàn)1206bp和5231bp的電泳條帶（見圖2），與預(yù)期大小基本相符，經(jīng)過測序，測序結(jié)果與目的基因序列完全一致。說明pET-28a-c（+）-VH-L-L表達載體構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-c（+）-VH-L-L限制性酶切分析Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pET-28a-c（+）-VH-L-LM.DL1000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.經(jīng)NcoI/XhoI雙酶切的pET-28a-c（+）-VH-L-LM.DL1000 laddermarker；1.pET-28a-c（+）-VH-L-L digested with NcoI/XhoI

2.3 VH-L-L蛋白的誘導(dǎo)表達與純化 將構(gòu)建的VH-L-L基因克隆到PET28A載體上，轉(zhuǎn)化BL21DE3菌株，獲得工程菌株BL21DE3-VH-L-L。通過LB培養(yǎng)液培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)表達。經(jīng)過破菌、提蛋白、過鎳柱純化后，通過12%的聚丙烯酰胺凝膠檢測，表明獲得了分子量約51kD目的蛋白，與理論分子量大?。?1.072kD）相符，且只有單一條帶，說明純化后的蛋白已具有很高的純度，符合其他分析測試的要求（見圖3、圖4）。

圖3 VH-L-L基因工程菌表達分析圖M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)大腸桿菌總蛋白；2.IPTG誘導(dǎo)3H表達蛋白；3.IPTG誘導(dǎo)1H表達蛋白；4，5，6.IPTG誘導(dǎo)2H表達蛋白Fig.3 Protein expression graph of gene engineering E.coliwith VH-L-LM.Molecular weightmarker for protein；1.Total protein of E.coli uninduced；2.Expressional protein induced 3h by IPTG；3.Expressional protein induced 1h by IPTG；4，5，6.Expressional protein induced 2h by IPTG

圖4 VH-L-L蛋白純化分析圖M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后的VH-L-L蛋白；2.IPTG誘導(dǎo)3H表達蛋白Fig.4 Protein purification graph of VH-L-LM.Molecular weightmarker for protein；1.Purified VH-L-L protein；2.Expressional protein induced 3 h by IPTG

2.4 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SWISS-MODEL對VH-L-L進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示：用在線軟件SWISS-MODEL以數(shù)據(jù)庫中的模板序列2xra.1.C對提交的VH-L-L蛋白氨基酸序列進行蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測的同源模建，2者序列相似性為93.46%。預(yù)測結(jié)果可見VH-L-L蛋白存在大量的β折疊、無規(guī)則卷曲，α-螺旋和β轉(zhuǎn)角較少。該蛋白是由一個較大的折疊的重鏈和一個螺旋折疊的輕鏈經(jīng)由一段肽鏈螺旋扭轉(zhuǎn)卷曲形成的空間立體結(jié)構(gòu)（見圖4）。

圖5 VH-L-VL的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Tertiary structure prediction of VH-L-L

2.5 用NanoZSP表征目的蛋白VH-L-L的粒度 將常規(guī)洗脫緩沖液和溶有HL-L-L的洗脫緩沖液2種樣品利用粒徑測定儀從數(shù)量粒度分布、體積粒度分布、強度粒度分布進行分析，以對分布性最靈敏的強度粒度分布為指標(biāo)，觀察最大吸收峰的峰形和峰寬。經(jīng)過比較（見圖5A、B），在489.7 nm有一強峰，可以進一步確認(rèn)此峰為HL-L-L的粒徑峰，且主峰寬度較小，說明HLL-L粒子大小分布均勻，分散狀態(tài)良好，純化后獲得的是純度較高的粒徑大小相似的單一蛋白。

2.6 用NanoZSP表征目的蛋白VH-L-L的電位 將常規(guī)洗脫緩沖液和溶有HL-L-L的洗脫緩沖液2種樣品進行用NanoZSP表征后，經(jīng)過比較（見圖6A、B），說明HL-L-L的Zeta電勢為-38.1，說明HL-L-L蛋白帶負(fù)電。

圖6 常規(guī)洗脫緩沖液（A）和溶有HL-L-L洗脫緩沖液（B）的粒度分布的強度Fig.6 Size distribution by intensity of dissolved with HL-L-L elution buffer

圖7 常規(guī)洗脫緩沖液（A）和溶有HL-L-L洗脫緩沖液（B）的zeta電位分布Fig.7 Zeta potential distribution of dissolved with HL-L-L elution buffer

2.7 用VH-L-L對體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞處理，探究其抗腫瘤作用 實驗結(jié)果表明：HL-L-L對MCF-7細(xì)胞有一定抑制作用，與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并隨著HL-L-L含量的增高，抑制作用明顯增強（見圖7）。

圖8 不同濃度的HL-L-L對MCF-7細(xì)胞增殖抑制的影響Fig.8 Effect of different concentration HL-L-L on the proliferation inhibition of MCF-7cells.**P＜0.01，與空白組（0μmol/L HL-L-L）比較，compared with control group；#P＜0.05，與4μmol/L HL-L-L相比，compared with 4μmol/LHL-L-L

3 討論

表皮生長因子受體高表達于多種惡性腫瘤細(xì)胞，其異?；罨c腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞凋亡的抑制、血管生成、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)［13］。EGFR已成為腫瘤生物治療的一個理想靶點。目前靶向EGFR的治療策略主要是用單克隆抗體以及小分子酪氨酸激酶抑制劑阻斷EGFR信號傳導(dǎo)。利用配體或抗體將治療分子運送到高表達EGFR的腫瘤細(xì)胞局部也受到越來越多的關(guān)注。利用單鏈抗體作為靶向分子具有以下優(yōu)點：①分子量小，具有較好的穿透性；②可以直接從大型人源抗體庫中篩選出來，實現(xiàn)人源化；③容易對其進行改造，幫助實現(xiàn)特定的功能；④易大規(guī)模生產(chǎn)等［14］。這些優(yōu)點較好地彌補了鼠源性單克隆抗體的缺點，其獨特的優(yōu)勢及其在抗腫瘤方面的巨大應(yīng)用前景使其成為目前臨床與基礎(chǔ)研究的熱點。

本實驗成功構(gòu)建了原核表達載體pET-28a-c（+）-VH-L-L；獲得了較高純度的VH-L-L蛋白，并成功預(yù)測了其三維結(jié)構(gòu)；其粒度約為489.7nm，且Zeta電勢為-38.1，帶負(fù)電。在蛋白結(jié)構(gòu)與功能的探索中，生物信息學(xué)的在線服務(wù)、軟件等是有利的工具。目前各種預(yù)測功能的平臺和軟件眾多，各自采用的算法不同，所預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性也不完全相同［15］。因此，結(jié)構(gòu)的預(yù)測盡可能選取同類預(yù)測軟件的多款軟件分別進行預(yù)測。且HL-L-L粒子大小分布均勻，分散狀態(tài)良好，純化后獲得的是純度較高的粒徑大小相似的單一蛋白；HL-L-L對MCF-7具有一定的增殖抑制效果，與空白組相比具有顯著的增殖抑制作用（P＜0.01）；成功表達了全人源藥用抗EGFR ScFv（HL-L-L）。其對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用顯著。為下一步研制抗EGFR的小分子抗體藥物提供基礎(chǔ)。

前人對EGFR單鏈抗體的的研究大都是非人源的，且還沒成藥的ScFv。本實驗中為全人源藥用抗EGFR ScFv（HL-L-L），且全人源抗EGFR單克隆抗體已上市，本實驗構(gòu)建的VH、L基因源于已成藥的全人源抗EGFR單克隆抗體基因，突破了實驗室的研究，更好的把科研與生產(chǎn)相結(jié)合，為以后全人源藥用抗EGFR ScFv（HL-L-L）的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

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（編校：吳茜）

Construction，expression，and the analysis of antitumor activity of all anthropogenic medicinal anti-EGFR ScFv（HL-L-L）

LISu-fen1，GUO Shang-jing2Δ

（1.College of Life Science，Liaocheng University，liaocheng 252000，China；2.College of Pharmacy，Liaocheng University，liaocheng 252000，China）

ObjectiveTo construct，express and analysis the antitumor activity of anti-EGFR ScFv（HL-L-L），and analyze bioinformatics and characterize correlation spectroscopy.MethodsEGFR ScFv（HL-L-L）gene was obtained by OVER LAPING technology and construction of prokaryotic expression vector pET-28a-c（+）-VH-L-L.After induced expression，target protein HL-L-L was purified by Ni column，and its tertiary structures was predicted with SWISS-MODEL；size distribution and zeta potential distribution of the target protein HL-L-L were characterized by NanoZSP；the inhibition effects of HL-L-L on breast cancer cell proliferation were studied with themethod of pharmacology.ResultsProkaryotic expression vector pET-28a-c（+）-VH-L-Lwas constructed successfully，high purity of protein HL-L-Lwas obtained，and successfully predicted its three-dimensional structure；the sizewas about489.7 nm，and the Zeta potentialwas38.1，negatively charged.Ithad a certain inhibition effecton MCF-7 proliferation，compared with blank group，and the difference was significant（P＜0.01）.ConclusionThis study successfully express all anthropogenic medicinal anti-EGFR ScFv（HL-L-L），which has significant inhibiting effect on breast cancer cell proliferation.It provides the foun dation for further development of small molecules of anti-EGFR antibody drug.

all anthropogenic；EGFR；ScFv；anti-tumor

R9

A

1005-1678(2014）07-0072-05

國家高新技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃，SS2012AA020704）

李素芬，女，碩士在讀，研究方向：植物學(xué)，E-mail：15165828017@ 163.com；郭尚敬，通信作者，男，在讀博士后，教授，研究方向：基因工程藥物、植物生物反應(yīng)器，E-mail：1069617062@qq.com。