李鐵軍，印春銘Δ，蔡淑女

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院麻醉科，遼寧建平110032；2.浙江省腫瘤醫(yī)院普外科，浙江杭州310000）

帕瑞昔布對(duì)肝部分切除大鼠海馬炎癥反應(yīng)的影響及可能機(jī)制

李鐵軍1，印春銘1Δ，蔡淑女2

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院麻醉科，遼寧建平110032；2.浙江省腫瘤醫(yī)院普外科，浙江杭州310000）

目的研究帕瑞昔布對(duì)肝部分切除后大鼠海馬炎癥反應(yīng)的影響及可能機(jī)制。方法選取72只SPF級(jí)雄性健康SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(C組）、麻醉組(A組）、手術(shù)組(S組）、帕瑞昔布組(P組）4組，每組18只。采用肝部分切除術(shù)建立手術(shù)創(chuàng)傷致海馬炎癥動(dòng)物模型。麻醉后1、3、7 d處死大鼠，檢測(cè)海馬組織炎癥介質(zhì)的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)環(huán)氧合酶-2(COX-2）mRNA的表達(dá)量，Western blot檢測(cè)COX-2、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3）的蛋白表達(dá)量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA）檢測(cè)前列腺素E2(PGE2）的含量。結(jié)果與C組相比，A組大鼠海馬組織中COX-2表達(dá)(蛋白、mRNA），PGE2含量，Caspase-3蛋白表達(dá)均差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；S組、P組大鼠術(shù)后第1、3天COX-2，PGE2，Caspase-3表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.05，P＜0.01），尤以術(shù)后第1天明顯(P＜0.01），術(shù)后第7天上述各炎癥指標(biāo)表達(dá)恢復(fù)正常。與S組相比，P組術(shù)后第1、3天COX-2，PGE2，Caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論肝部分切除術(shù)可導(dǎo)致海馬炎癥反應(yīng)，帕瑞昔布鈉可顯著抑制此種炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與下調(diào)海馬COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)，降低PGE2含量和Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

帕瑞昔布；COX-2；Caspase-3；海馬；炎癥

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（post-operative cognitive dysfunction，POCD）多表現(xiàn)為焦慮，精神錯(cuò)亂，學(xué)習(xí)和記憶功能減退。POCD可持續(xù)數(shù)周，數(shù)月甚至數(shù)年，嚴(yán)重者可發(fā)展為癡呆［1-3］。與POCD的死亡率相關(guān)的數(shù)據(jù)令人感到不安。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，與未患POCD的病人相比，在術(shù)后前3個(gè)月患POCD的病人死亡率更高［4］。因此，近年來POCD越來越受到關(guān)注，成為研究熱點(diǎn)。老年癡呆癥、帕金森病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究顯示［5］，COX-2抑制劑可抑制中樞炎癥反應(yīng)從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。那么COX-2是否參與手術(shù)應(yīng)激引起的海馬炎癥反應(yīng)？COX-2抑制劑能否抑制這種炎癥？本研究旨在針對(duì)以上問題進(jìn)行探討，為手術(shù)應(yīng)激后海馬炎癥反應(yīng)的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使其成為治療POCD的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本實(shí)驗(yàn)選取72只SPF級(jí)雄性健康SD大鼠，月齡12月，體質(zhì)量（500±50）g，購(gòu)買于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（鄂）2012-0005，在武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心由專人飼養(yǎng)于有通風(fēng)設(shè)施的恒溫動(dòng)物房，嚴(yán)格控制光照周期為12 h，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 試劑和儀器：MLS-85C型電泳槽（北京康來公司）；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；ZHWY100A恒溫?fù)u床（沃德生物儀器）；DY89-I型電動(dòng)勻漿器（寧波新芝科器研究所）；電子天平BT224S（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；pH計(jì)（美國(guó)Cole-Parmer公司）；HH-60三用數(shù)顯恒溫循環(huán)水箱（中國(guó)國(guó)華公司）；ABI Prism7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；-20℃冰箱（中國(guó)海爾公司）；超低溫冰箱（美國(guó)Forma Scientific公司）；MR23i高速多功能冷凍離心機(jī)（法國(guó)JOUAN公司）；HR-PCR-96G梯度PCR儀（中國(guó)青島海爾集團(tuán)）；Mini-PROTEAN3電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；紫外分光光度計(jì)DU530（美國(guó)Beckman公司）；酶標(biāo)儀RT-6000（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；恒溫箱（重慶永恒實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

大鼠PGE2 ELISA試劑盒（上海信然生物技術(shù)有限公司）；βactin抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；COX-2抗體、Caspase-3抗體（Cell Signaling公司）；兔抗鼠二抗（KPL公司）；苯甲基磺酰氟（德國(guó)Serva公司）；脫氧鵝膽酸（美國(guó)Sigma公司）；預(yù)染Marker（普利萊基因技術(shù)公司）；聚偏二氟乙烯（PVDF）（Pierce公司）；化學(xué)發(fā)光試劑盒ECL（碧云天公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組給藥：72只SPF級(jí)雄性健康SD大鼠，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（C組，n=18）、麻醉組（A組，n=18）、手術(shù)組（S組，n=18）、帕瑞昔布組（P組，n=18）。采用肝部分切除術(shù)建立手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致海馬炎癥的動(dòng)物模型。C組大鼠腹腔注射生理鹽水3mL。A組大鼠腹腔注射戊巴比妥40 mg/kg加芬太尼40μg/kg麻醉。S組大鼠腹腔注射與A組等量的麻醉藥后行肝部分切除術(shù)。P組大鼠腹腔注射與A組等量的麻醉藥后行肝部分切除術(shù)，并于術(shù)前0.5 h腹腔注射帕瑞昔布鈉10mg/kg，術(shù)后每天腹腔注射帕瑞昔布鈉2mg/kg直至處死，其他各組均腹腔注射等量生理鹽水。麻醉后1、3、7 d處死大鼠，檢測(cè)海馬組織炎癥介質(zhì)的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)環(huán)氧合酶-2（COX-2）mRNA的表達(dá)量，Western blot檢測(cè)COX-2、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的蛋白表達(dá)量，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)前列腺素E2（PGE2）的含量。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立：手術(shù)時(shí)間為上午8點(diǎn)至10點(diǎn)，手術(shù)室溫度穩(wěn)定在20℃～25℃，術(shù)前1天對(duì)手術(shù)室進(jìn)行紫外線消毒，對(duì)手術(shù)器械及敷料進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌，術(shù)前動(dòng)物禁食12h。大鼠腹腔注射戊巴比妥40mg/kg加芬太尼40μg/kg（藥物總體積為3mL）進(jìn)行麻醉，當(dāng)大鼠角膜反射遲鈍，翻正反射消失，呼吸深慢，表明大鼠已進(jìn)入麻醉狀態(tài)。用4根繩子將手術(shù)動(dòng)物固定于鼠板上，用1根細(xì)絲線固定牙齒，并用一塊干凈的敷料墊高腹部便于暴露。剪去大鼠腹部毛發(fā)備皮，行心電監(jiān)護(hù)，活力碘消毒后鋪無菌巾。行劍突下直切口，長(zhǎng)約2～3 cm，游離肝左葉，并用小止血鉗夾閉肝左葉動(dòng)、靜脈。在止血鉗下用3號(hào)縫線結(jié)扎2次，沿止血鉗上緣切下肝左葉。用37℃溫鹽水沖洗腹部2次以減少污染，用無菌紗布擦干。整理臟器位置，用小圓針單純連續(xù)縫合肌層?；盍Φ庀荆∪轻槅渭冮g斷縫皮。傷口處用0.25%布比卡因局部浸潤(rùn)麻醉以緩解傷口疼痛，用小敷貼包扎傷口。分別于手術(shù)開始前，手術(shù)結(jié)束時(shí)和手術(shù)1 h皮下注射1 mL生理鹽水以替代失液失血。術(shù)中嚴(yán)格無菌操作，對(duì)大鼠實(shí)行心電監(jiān)護(hù)以保證其生命體征平穩(wěn)。麻醉過程中將大鼠舌頭拉出口腔，間斷抽吸呼吸道分泌物，以保證其呼吸道通暢。待動(dòng)物完全蘇醒后放入籠中飼養(yǎng)。每天在傷口處擦拭活力碘進(jìn)行消毒，并及時(shí)更換傷口敷料直至處死。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)：COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)測(cè)定：每組取6只大鼠，腹腔注射戊巴比妥40mg/kg加芬太尼40 ug/kg麻醉后，斷頭處死并參照大鼠腦立體定位圖譜，在冰盤上分離出海馬組織，迅速凍存于-70℃冰箱以備后續(xù)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠海馬COX-2的mRNA的表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

PGE2的含量測(cè)定：每組各取6只大鼠，腹腔注射戊巴比妥40mg/kg加芬太尼40 ug/kg麻醉后，斷頭處死并參照大鼠腦立體定位圖譜，在冰盤上分離出海馬組織，并迅速凍存于-70℃冰箱以備后續(xù)ELISA檢測(cè)。ELISA操作步驟均嚴(yán)格按照所購(gòu)買試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 For Windows XP統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)“±s”來表示，各組均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），用最小顯著差異法（least-significant difference，LSD）行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麻醉和手術(shù)對(duì)大鼠海馬COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，麻醉組各時(shí)點(diǎn)COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1）。

手術(shù)組大鼠術(shù)后第1、3天COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），尤以術(shù)后第1天明顯（P＜0.01），并于術(shù)后第7天恢復(fù)正常。帕瑞昔布組大鼠術(shù)后第1天COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)（P＜0.01），于術(shù)后第3天恢復(fù)正常。與手術(shù)組相比，帕瑞昔布組術(shù)后第1、3天COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，見圖2）。

圖2 手術(shù)對(duì)大鼠海馬COX-2 mRNA（A）和蛋白（B）表達(dá)的影響C：對(duì)照組；S1：第1天手術(shù)組；S3：第3天手術(shù)組；S7第7天手術(shù)組；P1：第1天帕瑞昔布組；P3：第3天帕瑞昔布組；P7：第7天帕瑞昔布組**P＜0.01，*P＜0.05，與C組比較；#P＜0.05，與同時(shí)間點(diǎn)S組比較Fig.2 Effect of operation on rat hippocampal COX-2 mRNA（A）and protein（B）expressionC：control group；S1：1 day after operation；S3：3 days after operation；S7：7 days after operation；P1：1 day after given parecoxib；P3：3 days after given parecoxib；P7：7 days after given parecoxib**P＜0.01，*P＜0.05，compared with the group C；#P＜0.05，compared with those in group S

2.2 麻醉和手術(shù)對(duì)大鼠海馬PGE2含量的影響 與對(duì)照組相比，麻醉組各時(shí)點(diǎn)PGE2含量無顯著差異。手術(shù)組和帕瑞昔布組大鼠術(shù)后第1、3天PGE2含量較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），尤以術(shù)后第1天明顯（P＜0.01）。與手術(shù)組相比，帕瑞昔布組術(shù)后第1、3天PGE2含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01，見圖3）。

圖3 手術(shù)對(duì)大鼠海馬PGE2含量的影響C：對(duì)照組；S1：第1天手術(shù)組；S3：第3天手術(shù)組；S7第7天手術(shù)組；P1：第1天帕瑞昔布組；P3：第3天帕瑞昔布組；P7：第7天帕瑞昔布組**P＜0.01，*P＜0.05，與C組比較；#P＜0.05，與同時(shí)間點(diǎn)S組比較Fig.3 Effects of operation on the content of PGE2 in the hippocampus of ratsC：control group；S1：1 day after operation；S3：3 days after operation；S7：7 days after operation；P1：1 day after given parecoxib；P3：3 days after given parecoxib；P7：7 days after given parecoxib **P＜0.01，*P＜0.05，compared with the group C；#P＜0.05，compared with those in group S

2.3 麻醉和手術(shù)對(duì)大鼠海馬Caspase-3蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，麻醉組各時(shí)點(diǎn)Caspase-3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖4）。

圖4 麻醉對(duì)大鼠海馬Caspase-3蛋白表達(dá)的影響C：對(duì)照組；A1：第1天麻醉組；A3：第3天麻醉組；A7：第7天麻醉組Fig.1 Effect of anesthesia on rat hippocampalCaspase-3 protein expressionC：control group；A1：1 day after anesthesia；A3：3 days after anesthesia；A7 group：7 days after anesthesia

手術(shù)組和帕瑞昔布組大鼠術(shù)后第1、3天Caspase-3蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），尤以術(shù)后第1天明顯（P＜0.01）。與手術(shù)組相比，帕瑞昔布組術(shù)后第1、3天Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，見圖5）。

圖5 手術(shù)對(duì)大鼠海馬Caspase-3蛋白表達(dá)的影響C：對(duì)照組；S1：第1天手術(shù)組；S3：第3天手術(shù)組；S7第7天手術(shù)組；P1：第1天帕瑞昔布組；P3：第3天帕瑞昔布組；P7：第7天帕瑞昔布組**P＜0.01，*P＜0.05，與C組比較；#P＜0.05，與同時(shí)間點(diǎn)S組比較Fig.5 Effect of operation on the expression of Caspase-3 protein in hippocampus of ratsC：control group；S1：1 day after operation；S3：3 days after operation；S7：7 days after operation；P1：1 day after given parecoxib；P3：3 days after given parecoxib；P7：7 days after given parecoxib **P＜0.01，*P＜0.05，compared with the group C；#P＜0.05，compared with those in group S

3 討論

肝部分切除術(shù)是一種研究POCD發(fā)生機(jī)制及病理變化的有效動(dòng)物模型［6-8］。近期的一些研究發(fā)現(xiàn)，肝部分切除術(shù)后急性期（一般為術(shù)后7 d內(nèi)）和一定的時(shí)間范圍內(nèi)（術(shù)后30 d），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)不同程度的學(xué)習(xí)和記憶功能下降等認(rèn)知功能減退的表現(xiàn)，與此同時(shí)動(dòng)物海馬發(fā)生與認(rèn)知功能減退相應(yīng)的炎癥反應(yīng)［9-12］。在海馬組織中可檢測(cè)到炎癥因子如TNF-α，IL-1β等表達(dá)顯著上調(diào)的炎癥表現(xiàn)，并有相應(yīng)的形態(tài)學(xué)證據(jù)證明海馬炎癥反應(yīng)的存在［13］。帕瑞昔布鈉是目前臨床上廣泛應(yīng)用的特異性COX-2抑制劑之一［14］。動(dòng)物腹腔注射帕瑞昔布鈉后，藥物可迅速吸收入血，并能快速通過血腦屏障發(fā)揮其藥理學(xué)作用［15］。本研究采用肝部分切除術(shù)建立手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致海馬炎癥反應(yīng)的模型，并觀察圍術(shù)期使用特異性COX-2抑制劑帕瑞昔布鈉對(duì)海馬炎癥反應(yīng)的影響。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明手術(shù)干預(yù)即肝部分切除術(shù)可引起海馬炎癥反應(yīng)并可能通過激活Caspase-3啟動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡反應(yīng)。術(shù)后第1天和術(shù)后第3天在相同時(shí)間點(diǎn)與手術(shù)組相比較，術(shù)后給藥組COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)表達(dá)水平顯著降低。這提示藥物干預(yù)即帕瑞昔布鈉的運(yùn)用可顯著下調(diào)COX-2在基因水平和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)并通過調(diào)控其下游因子從而達(dá)到減輕海馬炎癥反應(yīng)的作用。對(duì)照組大鼠海馬COX-2的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)與第7天各組和第3天P組的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)無顯著差異，且低于其他各組COX-2的mRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)。隨著時(shí)間推移各組大鼠海馬COX-2的mRNA和蛋白的表達(dá)趨于恢復(fù)正常。說明肝部分切除術(shù)后的海馬炎癥反應(yīng)在沒有藥物干預(yù)的情況下在術(shù)后第1天達(dá)到高峰，于術(shù)后第7天恢復(fù)。而運(yùn)用帕瑞昔布鈉干預(yù)后于術(shù)后第3天或者更早的時(shí)間恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，麻醉組大鼠與對(duì)照組大鼠海馬COX-2mRNA和蛋白表達(dá)，PGE2含量，Caspase-3的蛋白表達(dá)均無顯著差異。這表明，麻醉因素在本研究中對(duì)肝切除術(shù)后大鼠海馬炎癥反應(yīng)無顯著影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)大鼠海馬COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)表達(dá)水平在運(yùn)用帕瑞昔布鈉干預(yù)后于術(shù)后第3天或者更早的時(shí)間恢復(fù)，而PGE2含量，Caspase-3的蛋白表達(dá)則在術(shù)后第3天并未恢復(fù)正常。它們之間存在著一個(gè)時(shí)間上的延遲。這個(gè)現(xiàn)象提示PGE2，Caspase-3可能是COX-2的下游因子。

綜上所述，肝部分切除術(shù)可導(dǎo)致海馬炎癥反應(yīng)，帕瑞昔布鈉可顯著抑制此種炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與下調(diào)海馬COX-2mRNA和蛋白表達(dá)，降低PGE2含量和Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)，且得出以下結(jié)論：①大鼠肝部分切除術(shù)可導(dǎo)致短暫的海馬炎癥反應(yīng)；②帕瑞昔布鈉可顯著抑制此種炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與下調(diào)海馬COX-2mRNA和蛋白表達(dá)，PGE2含量和Caspase-3的蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（編校：吳茜）

Effect of parecoxib on hippocampal inflammation in partial hepatectomy rats and its possiblemechanism

LITie-jun1，YIN Chun-ming1Δ，CAIShu-nv2

（1.Department of Anesthesiology，The Fourth Hospital Affiliated to China Medical University，Jianping 110032，China；2.Department of General Surgery，The Tumor Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310000，China）

ObjectiveTo investigate the effect of parecoxib on hippocampal inflammation following partial hepatectomy in rats.Methods72 SPF male healthy SD ratswere selected and random ly divided into four groups：control group（group C），anesthesia group（group A），operation group（group S），parecoxib group（group P），each had 18 rats.Using partial hepatectomy operation trauma to establish animal model of hippocampal inflammation.Ratswere sacrificed 1，3，7 days after anesthesia，the expression of inflammatory mediators in hippocampal tissue were detected.The expression of cyclooxygenase-2（COX-2）mRNA were detected by real-time quantitative PCR，and COX-2 and cysteine proteinase-3（Caspase-3）protein expression were detected by Western blot，the prostaglandin E2（PGE2）contentwere detected by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsCompared with control group，COX-2 expression（protein and mRNA），PGE2 production and Caspase-3 protein expression in group A had no significant difference.In group S and P，COX-2 expression，PGE2 and Caspase-3 protein expression increased significantly on 1st day postoperatively to 3rd day（P＜0.05 or P＜0.01），and they were obvious especially in the postoperative 1st day（P＜0.01）.The above inflammation index expression returned to normal in 7th days after operation.Compared with group S，COX-2 expression，PGE2 and Caspase-3 protein expression increased significantly on 1stday postoperatively to 3rd day（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionPartial hepatectomy could induce hippocampal inflammatory response in the rats. Parecoxib could suppress the hippocampal inflammation via the down-regulation expression of COX-2mRNA and protein，PGE2 and Caspase-3 protein in rats.

parecoxib；COX-2；Caspase-3；hippocampus；inflammation

R687.4

A

1005-1678(2014）07-0061-05

浙江省衛(wèi)生廳（2012KYB032）

李鐵軍，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：臨床麻醉，E-mail：qch1821460032@163.com；印春銘，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：麻醉藥與氣道防御，E-mail：qch1821460200@163.com。