邢東亮，宋東奎，康鄭軍，酒濤，湯棟棟

（1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州450052；2.鄭州大學(xué)一附院泌尿外科，河南鄭州450052；3.河南省空軍醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州450000）

干擾素-γ對腎癌細胞增殖干預(yù)的機制研究

邢東亮1，宋東奎2Δ，康鄭軍1，酒濤1，湯棟棟3

（1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州450052；2.鄭州大學(xué)一附院泌尿外科，河南鄭州450052；3.河南省空軍醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州450000）

目的研究干擾素-γ(IFN-γ）對腎癌細胞增殖干預(yù)的機制。方法應(yīng)用濃度1 000、2 000、3 000 U/mL的IFN-γ處理腎癌786-0細胞株，在處理24、48、72 h后，采用CCK-8法測定細胞增殖抑制率，采用流式細胞儀分析細胞周期，采用RT-PCR法檢測肝細胞粘附分子(hepaCAM）mRNA的表達，采用Western bolt方法檢測MAD1蛋白表達情況。結(jié)果不同濃度的IFN-γ對腎癌細胞的增殖均有抑制作用，相同濃度不同時間抑制率72h＞48 h＞24 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；相同作用時間，IFN-γ濃度越大，抑制率越大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；細胞周期分布結(jié)果顯示，實驗組腎癌細胞在處理48 h后出現(xiàn)G0/G1期增殖異常；與對照組(39.89）比較，實驗組增殖指數(shù)(25.65）明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；結(jié)果顯示，實驗組腎癌細胞在處理48 h后，與對照組比較，hepaCAM、MAD1蛋白表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。結(jié)論干擾素-γ可以通過促進hepaCAM基因表達，使MAD1蛋白表達升高，阻礙腎癌細胞增殖過程，對臨床具有指導(dǎo)意義。

腎癌；干擾素-γ；細胞增殖；干預(yù)機制

腎癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤，多來源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)，又稱腎細胞癌［1］。本病臨床表現(xiàn)為腰痛和血尿，部分出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、高血壓、紅細胞增多癥、神經(jīng)肌肉病變、溢乳癥等副瘤綜合癥，晚期腫瘤轉(zhuǎn)移出現(xiàn)骨痛、咯血等，但有60%以上的患者臨床癥狀不明顯，在健康體檢時發(fā)現(xiàn)腎癌［2］。本病多發(fā)于中老年人群，男女比例為2：1左右，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計，我國腎癌患者的發(fā)病率占到成人惡性腫瘤的3%左右，并有逐年上升趨勢，且30%～40%在發(fā)現(xiàn)時已處于晚期［3］。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子學(xué)技術(shù)的發(fā)展，本病人們更加重視本病的防治及預(yù)后，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取根治性腎切除手術(shù)等外科療法，但再復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率非常高［4］，5年生存率在10%以下，預(yù)后不良。研究發(fā)現(xiàn)［5］，干擾素-γ（IFN-γ）能夠作用于腫瘤細胞，發(fā)揮促進細胞凋亡、防止腫瘤內(nèi)血管形成以及提高免疫功能的作用，能夠抑制腫瘤細胞增殖，為了觀察其對腎癌細胞的作用，改善腎癌預(yù)后，筆者做了有關(guān)研究。通過觀察干擾素-γ對腎癌細胞抑制率、處理后腎癌細胞株的細胞周期、肝細胞粘附分子（hepaCAM）mRNA的表達情況、MAD1蛋白表達情況等指標，來探究干擾素-γ對腎癌細胞增殖干預(yù)的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象：采用腎癌786-0細胞株進行離體實驗，細胞株以及hepaCAM腺病毒質(zhì)粒來自于中國醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實驗室。

1.1.2 主要試劑和儀器：美國PeproTech的重組人細胞因子IFN-gamma；武漢三鷹的兔抗人hepaCAM多克隆抗體；武漢博士德的兔抗人MAD1多克隆抗體；北京中杉的二抗免疫組織化學(xué)試劑盒、枸櫞酸鈉緩沖液、DAB顯色試劑盒；日本TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒；國產(chǎn)RPMI1640、小牛血清、PBS、7sea-CCK-8等；國產(chǎn)細胞培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱；德國eppendorf的高速低溫離心機；德國Leica的光學(xué)顯微鏡；美國Thermo的酶標儀；美國BIO-RAD的凝膠成像分析儀、電泳儀、PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖抑制率檢測［6］：取生長程度在85%以上的腎癌細胞標本，采用0.25 g/L的胰蛋白酶進行消化，制成一定濃度的細胞懸液，取96孔培養(yǎng)板，將細胞按每孔100μL懸液植入板中，同時采用加了等量培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔作為空白對照組；2組均于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱孵育24 h，12 h后棄上清液；實驗組中分別加入1 000、2 000、3 000 U/mL的IFN-γ，每種5個復(fù)孔，對照組中加入等量培養(yǎng)基；分別在設(shè)定好的細胞培養(yǎng)箱中處理24、48、72 h；培養(yǎng)完成后，將CCK-8稀釋后，于每孔加入100 mL試劑，繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h之后，將酶標儀的波長設(shè)為450 nm，測定每個的吸光值，并計算其平均值A(chǔ)。細胞增殖抑制率IR=（實驗組A值-對照組A值）/對照組A值×100%。

1.2.2 細胞周期分析：采用流式細胞儀分析細胞周期［7］。將腎癌細胞株接種到培養(yǎng)瓶中，濃度為105個/mL，培養(yǎng)至細胞占到培養(yǎng)瓶的85%左右，更換培養(yǎng)基；將標本分為2組，實驗組加入濃度為1 000 U/mL的IFN-γ，對照組加入等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h；之后采用0.25 g/L的胰蛋白酶進行消化，離心機設(shè)置為2 000 r/min，離心5min取細胞；用PBS洗1遍重復(fù)離心后棄去上清液；75%乙醇預(yù)冷后加入細胞中，保持溫度為4℃，過夜；利用37℃水浴鍋消化30min，加入100μg/mL的PI染料，0.5 h后上機檢測；采用流式細胞儀檢測G0/G1期、S期、G2/M期細胞百分比，并計算其變化情況。

1.2.3 hepaCAM mRNA的表達檢測：采用RT-PCR法［8］檢測hepaCAM mRNA的表達，β-actin作為內(nèi)參。將腎癌細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔100個，培養(yǎng)48 h，實驗組加入濃度為1 000 U/mL的IFN-γ，對照組加入等量培養(yǎng)基；取出細胞，加入RNA OUT使RNA裂解，提取細胞內(nèi)的RNA，檢測其濃度；在冰上根據(jù)說明書加入10μL試劑，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存在-20℃冰箱內(nèi)；將標本震蕩離心后針對需要的引物系列進行PCR擴增，擴增所需要的序列，取5μL的擴增產(chǎn)物，置于1.5%瓊脂糖凝膠上，采用80 V電泳，作用30min后利用BIO-RAD成像儀獲得產(chǎn)物圖片，比較hepaCAM和β-actin的灰度值。

1.2.4 MAD1蛋白的表達檢測：采用Western bolt方法［9］檢測MAD1蛋白表達情況。將腎癌細胞株接種到培養(yǎng)瓶中，待培養(yǎng)至細胞占到培養(yǎng)瓶的85%左右，棄掉培養(yǎng)基；沖洗后將細胞刮下，置于Ep管中，離心取沉淀物備用；加入細胞裂解液后，離心提取總蛋白；參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，測定蛋白濃度；取等量蛋白分為，跑12%以及7.5%的分離凝膠；轉(zhuǎn)膜40 min；置于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h；采用兔抗人hepaCAM多克隆抗體、兔抗人MAD1多克隆抗體、二抗免疫組織化學(xué)試劑盒，依據(jù)抗體說明對標本進行培養(yǎng)，用PBST洗膜3次后滴加顯影劑，利用BIO-RAD成像儀獲得圖片，比較MAD1和β-actin的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，樣本率的比較采用卡方檢驗分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖抑制率比較 不同濃度的IFN-γ對腎癌細胞的增殖均有抑制作用，相同濃度不同時間抑制率72 h＞48 h＞24 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相同作用時間，IFN-γ濃度越大，抑制率越大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 不同濃度的IFN-γ作用于腎癌細胞后的增殖抑制率（%）Tab.1 Proliferation inhibition rate of renal cancer cell processed by different concentrations of IFN-γ（%）

2.2 細胞周期分布結(jié)果 檢測結(jié)果顯示，與對照組（39.89）比較，實驗組增殖指數(shù)（25.65）明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。IFN-γ作用于腎癌細胞后經(jīng)流式細胞儀分析細胞周期結(jié)果見圖1。

表2 IFN-γ對于腎癌細胞周期分布的影響Tab.2 Influence of IFN-γon kidney cancer cell cycle distribution

圖1 IFN-γ作用于腎癌細胞后經(jīng)流式細胞儀分析細胞周期結(jié)果Fig.1 The effect of IFN-γon renal carcinoma cell after flow cytometric cell cycle analysis results

2.3 IFN-γ處理后hepaCAM mRNA、MAD1蛋白的表達實驗組腎癌細胞在處理48 h后，與對照組比較，hepaCAM mRNA、MAD1蛋白表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖2，3）。

圖2 IFN-γ作用于腎癌細胞后RT-PCR檢測hepaCAM/β-actin mRNA表達水平1.對照組，2.實驗組**P＜0.01，與空白對照組比較Fig.2 The effect of IFN-γon the expression of hepa CAM/β-actin mRNA detected by RT-RCR in renal carcinoma cells1.control group；2.experiment group **P＜0.01，compared with control group

圖3 IFN-γ作用于腎癌細胞后MAD1蛋白表達水平1.對照組，2.實驗組**P＜0.01，與空白對照組比較Fig.3 The effect of IFN-γon the expression of MAD1 protein in renal carcinoma cells1.control group；2.experiment group **P＜0.01，compared with control group

3 討論

腎癌的發(fā)病率逐年升高，已成為泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一［10］，其以較高的死亡率嚴重威脅人們的生命健康。惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的根本原因是細胞的異常分化及過度增殖，從分子水平控制細胞過度增殖成為治療惡性腫瘤的新熱點。資料顯示［13］，免疫球蛋白類的細胞粘附因子對細胞增殖具有抑制作用，hepaCAM、MAD1蛋白均屬此類，有報道稱［12］腎癌患者體內(nèi)hepaCAM、MAD1蛋白表達水平均有所下降，且MAD1蛋白水平與hepaCAM基因表達下降有關(guān)。IFN-γ是Ⅱ型干擾素［13］，來自于活化的T細胞核自然殺傷細胞，研究發(fā)現(xiàn)［14］其可以通過調(diào)控抑制細胞增殖相關(guān)的基因，來達到促進細胞凋亡、防止腫瘤內(nèi)血管形成以及提高免疫力的目的。IFN-γ對腎癌細胞增殖干預(yù)的機制目前尚不明確，因此，筆者做了相關(guān)研究。研究結(jié)果顯示，不同濃度的IFN-γ對腎癌細胞的增殖均有抑制作用，相同濃度不同時間抑制率72 h＞48 h＞24 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相同作用時間，IFN-γ濃度越大，抑制率越大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；細胞周期分布結(jié)果顯示，實驗組腎癌細胞在處理48 h后出現(xiàn)G0/G1期增殖異常；與對照組（39.89）比較，實驗組增殖指數(shù)（25.65）明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；提示IFN-γ能夠?qū)⒓毎铚贕0/G1期，作用大小與濃度、時間有關(guān)，腎癌細胞正常的增殖需要一次經(jīng)過G1期、S期、G2期，若G1期受到阻礙細胞就會進入G0期，也就是休眠期，無法繼續(xù)增殖，本研究顯示IFN-γ即通過此途徑抑制腎癌細胞增殖，Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組hepaCAM、MAD1蛋白表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示IFN-γ可以通過調(diào)控hepaCAM基因表達，來使hepaCAM、MAD1蛋白表達水平上調(diào)。

綜上所述，干擾素-γ可以通過促進hepaCAM基因表達，使MAD1蛋白表達升高，阻礙腎癌細胞增殖過程，對臨床具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

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（編校：譚玲）

Study on themechanism of interferon-γon the proliferation of renal carcinoma cell intervention

XING Dong-liang1，SONG Dong-kui2Δ，KANG Zheng-jun1，JIU Tao1，TANG Dong-dong3

（1.Department of Urological Surgery，The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2.Department of Urological Surgery，The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；3.The Air Force Hospital of Henan Province，Zhengzhou 450000，China）

ObjectiveTo study themechanism of interferon-γ（IFN-γ）on the intervention of renal carcinoma cell proliferation.MethodsUsing concentration of1 000，2 000，3 000U/mL IFN-γtreatment of renal cell carcinoma 786-0 cell line，in 24 hours，48 hours，72 hours after treatment，the inhibition rate of cell proliferation was determined with CCK-8 method，using flow cytometric analysis of cell cycle，using RT-PCR for detection of hepaCAM mRNA，and using theWestern boltting method for detection of MAD1 protein expression.ResultsDifferent concentrations of IFN-γhad the inhibitory effects on renal cell carcinoma cell proliferation，the concentration of the inhibitory rate of 72 hoursand 48 hoursmore than 24 hours，the difference was statistically significant（P＜0.05）；at the same time，a higher IFN-γconcentration，the inhibition rate was greater，the difference was statistically significant（P＜0.05）；the cell cycle distribution results showed，the experimental group of renal carcinoma cells proliferation in the treatment of abnormal G0/G1 phase after 48 hours；and the control group（39.89）compared with the experimental group，the proliferation index（25.65）decreased significantly，the difference was statistically significant（P＜0.05）；results showed that，the experimental group in renal cell carcinoma cells after 48 h of treatment，compared with control group，hepaCNM mRNA，MAD1 protein expression increased obviously，the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionIFN-γcould increase the expression of MAD1by promoting hepaCAM expression，inhibits renal carcinoma cell proliferation.

renal cell carcinoma；IFN-γ；cell proliferation；intervention mechanism

R737

A

1005-1678(2014）07-0055-03

國家自然科學(xué)基金項目（81272823）

邢東亮，男，博士，研究方向：泌尿生殖系腫瘤，E-mail：drxdliang@ 126.com；宋東奎，通信作者，男，主任醫(yī)師，博士，博士生導(dǎo)師，E-mail：drsdkui @126.com。