雷莉妍，王 迪，張廣吉，郭佑銘，王麗萍，2

（1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)科，長(zhǎng)春 130033）

DhHP－6及Exenatide對(duì)胰島β細(xì)胞的協(xié)同作用

雷莉妍1，王 迪1，張廣吉1，郭佑銘1，王麗萍1，2

（1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)科，長(zhǎng)春 130033）

采用葡萄糖和棕櫚酸鈉（Glu－Pal）聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠胰島瘤RINm－5F細(xì)胞凋亡，用噻唑藍(lán)比色（MTT）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)次血紅素六肽（DhHP－6）和Exenatide分別或聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響.結(jié)果表明：DhHP－6和Exenatide均顯著抑制Glu－Pal誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，但二者無(wú)協(xié)同作用；DhHP－6和Exenatide均明顯促進(jìn)RINm－5F細(xì)胞增殖，且有顯著的協(xié)同作用.

次血紅素六肽；Exenatide；胰島β細(xì)胞；協(xié)同作用

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

大鼠胰島瘤細(xì)胞RINm－5F（美國(guó)ATCC公司）；DhHP－6和Exenatide由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物大分子實(shí)驗(yàn)組合成；葡萄糖（北京化工廠）；棕櫚酸鈉（美國(guó)Sigma公司）；PCR試劑及總RNA抽提試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；RPMI 1640和OPTI－MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Life Techologies公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）.

1.2 實(shí) 驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RINm－5F細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、2mmol／L谷氨酰胺和1.0mmol／L丙酮酸鈉）中，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).

1.2.2 Glu－Pal誘導(dǎo)RINm－5F細(xì)胞凋亡模型的建立 將密度為每孔2×104個(gè)的RINm－5F細(xì)胞接種于96孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，使細(xì)胞充分貼壁.棄去細(xì)胞上層培養(yǎng)基，加入含不同濃度配比的葡萄糖與棕櫚酸鈉的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，利用噻唑藍(lán)比色（MTT）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，建立細(xì)胞凋亡模型.

1.2.3 DhHP－3與Exenatide單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)Glu－Pal誘導(dǎo)RINm－5F細(xì)胞凋亡的影響 將密度為每孔2×104個(gè)的RINm－5F細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度的DhHP－6和Exenatide或不同濃度配比的DhHP－6和Exenatide的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)1h，加入Glu－Pal誘導(dǎo)RINm－5F細(xì)胞凋亡，繼續(xù)培養(yǎng)48h.用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率.

1.2.4 PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA水平 將密度為每孔106個(gè)的RINm－5F細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，分為空白組、凋亡模型組、DhHP－6保護(hù)組和Exenatide保護(hù)組，培養(yǎng)48h后提取mRNA.經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）和實(shí)時(shí)定量PCR（real time－PCR）檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況.以βctin作為內(nèi)參［12］，各基因的特異性引物序列列于表1.

表1 凋亡相關(guān)基因的特異性引物序列Table 1 Primers for genes related to apoptosis

1.2.5 DhHP－3與Exendin－4單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)RINm－5F細(xì)胞增殖的影響 將密度為每孔2×104個(gè)的RINm－5F細(xì)胞接種于96孔板中過(guò)夜培養(yǎng).棄去舊培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度的DhHP－6和Exenatide或不同濃度比的DhHP－6和Exenatide培養(yǎng)基培養(yǎng)24h.用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)增殖率.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布.結(jié)果以±SD表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，若p＜0.05，則數(shù)據(jù)視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 Glu－Pal誘導(dǎo)RINm－5F細(xì)胞凋亡模型的建立

研究表明，長(zhǎng)期高糖高脂能誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡［13］.本文用Glu和Pal聯(lián)合誘導(dǎo)RINm－5F細(xì)胞凋亡，檢測(cè)了不同濃度比例的Glu和Pal作用48h對(duì)RINm－5F細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖1所示.由圖1可見(jiàn)：高濃度的Pal對(duì)細(xì)胞存活率影響較大，且作用不穩(wěn)定；當(dāng)12.5mmol／L Glu和0.1mmol／L Pal作為凋亡誘導(dǎo)條件時(shí)，細(xì)胞凋亡率較合適（41.8%），且作用較穩(wěn)定.

2.2 DhHP－6及Exenatide對(duì)Glu－Pal誘導(dǎo)RINm－5F細(xì)胞凋亡的影響

當(dāng)c（Glu）＝12.5mmol／L，c（Pal）＝0.1mmol／L時(shí)，DhHP－6及Exanatide對(duì)Glu－Pal誘導(dǎo)RINm－5F細(xì)胞凋亡的影響如圖2所示.由圖2可見(jiàn)，二者的保護(hù)作用均具有濃度依賴(lài)性.其中DhHP－6對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用較強(qiáng)，當(dāng)DhHP－6的濃度為24μmol／L時(shí)，基本能完全抑制Glu－Pal誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.

2.3 DhHP－6及Exenatide對(duì)RINm－5F細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

高糖和高脂可引起bcl－2基因家族一些成員表達(dá)發(fā)生變化而誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡［14］.DhHP－6和Exenatide對(duì)RINm－5F細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA的影響如圖3所示.由圖3可見(jiàn)：與空白對(duì)照組相比，模型組抗凋亡基因bcl－2和sirt1mRNA表達(dá)量下降（分別為對(duì)照組的0.21和0.29倍），凋亡基因bax的mRAN表達(dá)量提高（約為對(duì)照組的1.43倍）；加入DhHP－6后，sirt1和bcl－2的mRNA表達(dá)量提高（分別為對(duì)照組的0.52和0.97倍），bax的mRNA表達(dá)量顯著下降（約為對(duì)照組的0.7倍）；加入Exenatide后，sirt1和bcl－2的mRNA表達(dá)量提高（分別為各自對(duì)照組的0.33和0.42倍），bax與模型組的mRNA表達(dá)量相比變化較小.DhHP－6和Exenatide對(duì)凋亡相關(guān)基因sirt1和bcl－2具有類(lèi)似的作用，但對(duì)bax的影響完全不同，表明二者可能通過(guò)不同的信號(hào)途徑發(fā)揮抗凋亡作用.

圖1 Glu－Pal誘導(dǎo)RINm－5F細(xì)胞凋亡Fig.1 Apoptosis of RINm－5Fcells induced by Glu－Pal

圖2 DhHP－6（A）及Exenatide（B）對(duì)Glu－Pal誘導(dǎo)的RINm－5F細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of DhHP－6（A）and Exenatide（B）on the apoptosis of RINm－5Fcells induced by Glu and Pal

圖3 DhHP－6和Exenatide對(duì)RINm－5F細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of DhHP－6and Exenatide on mRNA level of genes related to apoptosis in RINm－5Fcells

2.4 DhHP－6及Exenatide對(duì)RINm－5F細(xì)胞增殖的影響

利用不同濃度的DhHP－6或Exenatide處理RINm－5F細(xì)胞24h，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如圖4所示.由圖4可見(jiàn)，DhHP－6及Exenatide均顯著刺激RINm－5F細(xì)胞增殖，且二者的作用均具有濃度依賴(lài)性，其中DhHP－6的增殖活性更強(qiáng).

圖4 DhHP－6（A）和Exenatide（B）對(duì)RINm－5F細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of DhHP－6（A）and Exenatide（B）on the proliferation of RINm－5Fcells

2.5 DhHP－6和Exenatide聯(lián)合作用對(duì)RINm－5F細(xì)胞凋亡的影響

選擇c（DhHP－6）∶c（Exenatide）＝1∶2.5，并進(jìn)行梯度稀釋研究二者在抗RINm－5F細(xì)胞凋亡過(guò)程中的協(xié)同作用.用A表示DhHP－6對(duì)β細(xì)胞凋亡的抑制率，用B表示Exenatide對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制率，AB表示二者聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制率.若AB＞A＋B，則可判斷AB作用具有協(xié)同性.當(dāng)c（Glu）＝12.5mmol／L，c（Pal）＝0.1mmol／L時(shí)，不同濃度的DhHP－6與Exenatide聯(lián)合作用對(duì)RINm－5F細(xì)胞凋亡的影響如圖5所示.由圖5可見(jiàn)，DhHP－6和Exenatide聯(lián)合作用均大于DhHP－6和Exenatide單獨(dú)作用對(duì)RINm－5F細(xì)胞凋亡的抑制率，但小于DhHP－6和Exenatide單獨(dú)作用對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制率之和，因此二者的抗RINm－5F細(xì)胞凋亡作用沒(méi)有協(xié)同性.

2.6 DhHP－6和Exenatide聯(lián)合作用對(duì)RINm－5F細(xì)胞增殖的影響

選用c（DhHP－6）∶c（Exenatide）＝4，并進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)幚鞷INm－5F細(xì)胞24h，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)增殖率，結(jié)果如圖6所示.由圖6可見(jiàn)，DhHP－6和Exenatide聯(lián)合作用效果大于DhHP－6和Exenatide單獨(dú)作用效果之和，因此二者對(duì)促進(jìn)RINm－5F細(xì)胞增殖具有協(xié)同作用.

圖5 DhHP－6和Exenatide聯(lián)合作用對(duì)RINm－5F細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of DhHP－3combined with Exenatide on the apoptosis of RINm－5Fcells

圖6 DhHP－6和Exenatide聯(lián)合作用對(duì)RINm－5F細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of DhHP－6combined with Exenatide on the proliferation of RINm－5Fcells

綜上所述，DhHP－6和Exenatide均顯著抑制Glu－Pal誘導(dǎo)RINm－5F細(xì)胞凋亡，在促進(jìn)RINm－5F細(xì)胞增殖時(shí)具有顯著的協(xié)同作用.

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（責(zé)任編輯：?jiǎn)?凝）

Synergistic Effects of DhHP－6and Exenatide on PancreaticβCells

LEI Liyan1，WANG Di1，ZHANG Guangji1，GUO Youming1，WANG Liping1，2
（1.College of Life Science，Jilin University，Changchun130012，China；2.Department of Emergency，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun130033，China）

Apoptosis of pancreaticβcell RINm－5Fwas induced by glucose coupled with sodium palmitate.Effects of DhHP－6or／and Exenatide on the apoptosis of RINm－5Fcell were detected by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay.DhHP－6and Exenatide decreased the apoptosis induced by Glu－Pal significantly without no synergistic effect between them.In addition，we also found that DhHP－6and Exenatide both stimulated the proliferation of RINm－5Fcells，and there was a synergistic effect between them.

DhHP－6；Exenatide；pancreaticβcell；synergistic effect

Q28

A

1671－5489（2014）04－0835－05

2型糖尿病是一種慢性代謝綜合癥［1］，高糖是其顯著的臨床特征.由于高糖和高脂具有的細(xì)胞毒性會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡［2］，因此2型糖尿病患者的胰島β細(xì)胞數(shù)量均減少.

Exenatide是治療2型糖尿病的藥物，是一種胰高血糖素樣肽1（GLP－1）類(lèi)似物，但比GLP－1擁有更好的血漿穩(wěn)定性.Exenatide與胰島β細(xì)胞上的GLP－1受體有高度的親和性，在治療2型糖尿病過(guò)程中，Exenatide可促進(jìn)胰島素分泌，并具有促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖、分化和抗β細(xì)胞凋亡的作用［3－5］.次血紅素六肽（DhHP－6）是由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物大分子實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)并合成的過(guò)氧化物酶模擬物［6－8］.目前，多基因、多組織疾病，如腫瘤和糖尿病，單個(gè)靶點(diǎn)的藥物在治療時(shí)很難達(dá)到預(yù)期療效［9］.而針對(duì)多靶點(diǎn)的藥物聯(lián)合治療能同時(shí)調(diào)節(jié)疾病網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)環(huán)節(jié)，并且藥物間常表現(xiàn)出協(xié)同作用，具有突出的效果，在重大疾病治療中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛［10－11］.本文探討DhHP－6與Exenatide在胰島β細(xì)胞凋亡和增殖過(guò)程中的協(xié)同作用.

10.13413／j.cnki.jdxblxb.2014.04.40

2013－09－29.

雷莉妍（1985—），女，漢族，博士研究生，從事藥物篩選的研究，E－mail：liyanlei－2005＠163.com.通信作者：王麗萍（1967—），女，漢族，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事藥物篩選的研究，E－mail：wanglp＠jlu.edu.cn.

吉林省自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：201015171）、吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)：201205017）、吉林省醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)基金（批準(zhǔn)號(hào)：YYZX201150－2）和長(zhǎng)春市科技局社會(huì)發(fā)展科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)：12SF23）.