金 丹 吳明勇 劉建剛 袁淑芬 陳曉品

肺癌是我國目前發(fā)病率較高的癌癥之一，根據(jù)相關(guān)調(diào)查，男性的發(fā)病率高于女性，肺癌已經(jīng)成為男性發(fā)病和死亡率最高的癌癥。最近幾年，肺癌的臨床治療的研究目標(biāo)集中在基因水平上的靶向治療。根據(jù)研究[1]，TRPC1是第一個哺乳動物電位受體蛋白，屬于非選擇性陽離子蛋白通道，對癌癥細(xì)胞的增殖和侵襲等多種癌癥細(xì)胞的惡性行為產(chǎn)生一定的影響。我院針對SiRNA沉默TRPC1基因?qū)Ψ蜗侔〢549細(xì)胞增殖和侵襲的影響效果展開實驗研究，取得的效果比較滿意，現(xiàn)在將研究結(jié)果總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

主要材料：實驗室保存的在37℃下、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中、RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞，美國Sigma公司生產(chǎn)的MTT，美國Abcam公司生產(chǎn)的抗人TRPC1的一抗，美國Gibco公司生產(chǎn)的RPMI-1640培養(yǎng)基，孔徑為8.0 μm的小室，Cy3標(biāo)記物，美國Invitrogen公司生產(chǎn)的LipofectamineTM2000。

1.2 方法

TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞：將A549細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為每個孔2×105。第二天用血清培養(yǎng)液稀釋TRPC1-SiRNA(已經(jīng)進行Cy3標(biāo)記物標(biāo)記)250 μl，濃度分別稀釋到20、30、50以及100 mmol/L，然后與5 μl的LipofectamineTM2000室溫下孵育5 min后輕輕混合再孵育20 min,然后加入到6孔板接種的A549細(xì)胞的每個孔，在37℃下、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中6 h后換血清培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h。然后進行熒光定量PCR檢測。并計算轉(zhuǎn)染速率。

A549細(xì)胞的增殖檢測：將等量的100 mmol/L TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染試劑接種于8塊96孔的培養(yǎng)液中，密度是2×103，在5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔加入20 μl的MTT培養(yǎng)液，4 h后吸取培養(yǎng)液的上清液，加入150 μl DMSO，應(yīng)用酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀測定光密度值，計算增殖時間。

A549細(xì)胞侵襲實驗：先按照實驗室標(biāo)準(zhǔn)制備細(xì)胞侵襲實驗需要的小室膜。將未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞、TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染試劑400 μl加入上室，等量的培養(yǎng)液加入下室。4%多聚甲醛固定15 min，然后進行染色、水洗和風(fēng)干。制片封片后在顯微鏡下觀察并計算每個孔平均穿膜數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞在不同濃度、不同時間下的轉(zhuǎn)染速率，觀察未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞、TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染試劑的增殖時間和穿膜細(xì)胞數(shù)。分析TRPC1-SiRNA對肺腺癌的治療作用。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間計量資料采取F檢驗，以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度和時間下TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染速率情況

100 mmol/L TRPC1-SiRNA(Cy3標(biāo)記物標(biāo)記后)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h速率，明顯大于其他濃度時的速率。TRPC1-SiRNA(Cy3標(biāo)記物標(biāo)記后)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h和100 mmol/L濃度下轉(zhuǎn)染速率最大，兩個對照組的轉(zhuǎn)染時間和濃度也設(shè)定為48 h和100 mmol/L濃度，見表1。

表1 不同濃度TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染不同時間的轉(zhuǎn)染速率結(jié)果

注：#為轉(zhuǎn)染48 h，與其他濃度TRPC1-SiRNA轉(zhuǎn)染速率相比，P<0.05；100 mmol/L TRPC1-SiRNA濃度下，與其他時間的轉(zhuǎn)染速率相比，# 為P<0.05。

2.2 MTT法檢測A549細(xì)胞的增殖時間

TRPC1-SiRNA基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞增殖時間明顯短于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染試劑對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 MTT法檢測A549細(xì)胞的增殖時間結(jié)果

注：#為與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染試劑組比較，P<0.05。

2.3 肺腺癌細(xì)胞侵襲能力實驗結(jié)果

TRPC1-SiRNA基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞侵襲實驗中穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染試劑對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 肺腺癌細(xì)胞侵襲能力實驗中穿膜細(xì)胞數(shù)結(jié)果

注：#為與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染試劑組比較，P<0.05。

3 討論

肺腺癌是肺癌的1種，主要致病因素是支氣管上皮細(xì)胞癌變，少數(shù)是支氣管的粘液腺發(fā)生癌變。絕大多數(shù)較小的支氣管細(xì)胞癌變的肺腺癌屬于周圍型肺癌。肺腺癌發(fā)病早期顯的臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，患者不易察覺，胸部 X 線檢查時肺腺癌可以被發(fā)現(xiàn)。肺腺癌腫瘤形狀為圓形或橢圓形，據(jù)觀察生長速度比較緩慢，一般血行轉(zhuǎn)移發(fā)生在癌癥早期，淋巴轉(zhuǎn)移發(fā)生在肺腺癌晚期[2-3]。

TRPC1是位于細(xì)胞膜上的一類重要的非選擇性陽離子通道家族之一。曾有研究報道過鈣離子與腫瘤關(guān)系密切，能夠參與到腫瘤的增殖和侵襲等惡性生物學(xué)行為中[4]。非選擇性陽離子通道TRPC1作為調(diào)控細(xì)胞鈣離子通道的物質(zhì)，以前部分學(xué)者認(rèn)為該物質(zhì)參與到受體介導(dǎo)的、鈣依賴的平滑肌以及腺體的分泌和收縮功能。最近有國外研究證明[5-7]，TRPC1與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲行為等有關(guān)。SiRNA是通過RNA干擾技術(shù)在體內(nèi)或者體外培養(yǎng)產(chǎn)生的，會抑制同源性基因的表達(dá)，使同源細(xì)胞沉默，所以稱之為沉默基因。曹新梅等[8]研究證實SiRNA可以抑制某些癌基因的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物行為。本院的研究結(jié)果證明，SiRNA沉默TRPC1基因可抑制A549細(xì)胞的增殖能力，降低A549細(xì)胞的侵襲能力，本院這一研究結(jié)論恰好結(jié)合了國內(nèi)外對于SiRNA和TRPC1的研究結(jié)論。黃棟等人曾經(jīng)針對SiRNA沉默B7-H4基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染速率、癌細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移能力的研究，部分結(jié)論與本院的SiRNA沉默TRPC1基因相似[9-10]。結(jié)合國內(nèi)外多位醫(yī)學(xué)專家學(xué)者針對SiRNA各個亞型沉默基因的研究結(jié)論證實確實對癌細(xì)胞的惡性生物性行為有密切關(guān)系，可以應(yīng)用到癌癥的臨床治療中。

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