朱洪艷，陳蓉，姜藻

(1.東南大學附屬中大醫(yī)院 腫瘤中心，江蘇 南京 210009； 2.東南大學江蘇省分子影像與功能影像重點實驗室，江蘇 南京 210009)

肝細胞癌(hepatocellar carcinoma，HCC)是發(fā)病率僅次于胃癌的消化道惡性腫瘤之一，其血管化程度極高，病程進展迅速，目前尚缺乏有效性及安全性俱佳的治療方法[1- 2]，人們迫切期待安全有效的治療手段的出現(xiàn)，大多數(shù)學者把希望投向基因治療。內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells， EPCs)是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，可定向遷移到肝癌組織，在其他重要臟器中分布較少[3]，讓其攜帶自殺基因去殺傷肝癌細胞成為人們研究肝癌治療方法的新希望。本研究擬將自殺基因胞嘧啶脫氨酶(cytosicine deaminase，CD)基因轉染至鼠髓源性EPCs中，聯(lián)合使用酶前體藥物5- 氟胞嘧啶(5- FC)，觀察CD基因修飾的EPCs與5- FC對小鼠肝癌H22細胞的體外抗增殖作用，為干細胞/祖細胞作為基因治療載體治療肝細胞癌的體內(nèi)實驗及后續(xù)臨床研究提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞

5～6周齡普通昆明小鼠25只，雌雄不拘，體重20～30 g，由東南大學實驗動物中心提供，并飼養(yǎng)于該動物中心。肝癌H22細胞株購自于中國科學院上海藥物研究所。慢病毒載體plenti6.3- EGFP- CD及慢病毒對照液plenti6.3/V5- DEST來自于本實驗室前期工作[4]保存。

1.1.2 主要試劑和設備

內(nèi)皮細胞基礎培養(yǎng)液(EBM- 2)、Single Quots組合添加劑(Lonza，美國)，細胞培養(yǎng)基粉(RPMI1640)、高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國)，CD31 抗體(eBioscience公司，美國)，KDR抗體(Cell Signaling公司，美國)，F(xiàn)ITC- UEA- 1(Vector Laboratries公司)，Dil- ac- LDL(Biomedical Technologies公司，美國)，DAPI- Fluoromount- G(杭州聯(lián)科生物技術有限公司)，Polybrene轉染試劑(中山生物工程有限公司)，β- actin單克隆抗體和抗CD單克隆抗體(Sigma公司，美國)，CCK- 8試劑盒(上海易莎生物科技有限公司)，Transwell小室裝置(北京樂博生物科技有限公司)，流式細胞儀(BD公司，美國)，CO2培養(yǎng)箱(Herabus，德國)，倒置相差顯微鏡(Zeiss Axiovert25 CFL)，凈化工作臺(吳江市生化凈化設備廠)，原子吸收光譜儀(9602A，沈陽華光精密儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠骨髓EPCs分離、培養(yǎng)及鑒定

斷頸法處死昆明小鼠，密度梯度離心法分離小鼠骨髓單個核細胞，按照實驗室已建立的實驗方法[4- 5]進行EPCs的培養(yǎng)和鑒定。細胞爬片、冷丙酮固定后滴加CD31、KDR一抗溶液，37 ℃孵育1 h，陰性對照用PBS液代替一抗。沖洗干凈后滴加二抗工作液，37 ℃避光孵育30 min，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察細胞表面標記CD31和KDR表達情況。另外再選取生長良好的原代細胞，分別加入5 μg·ml-1Dil- ac- LDL和10 μg·ml-1FITC- UEA- 1后，熒光顯微鏡下觀察EPCs攝取Dil- ac- LDL和結合FITC- UEA- 1情況。

1.2.2 目的基因的轉染和鑒定

取生長旺盛的EPCs消化并計數(shù)，將5×104個細胞分別與攜帶目的基因(plenti6.3- EGFP- CD)的病毒液和慢病毒對照液(plenti6.3/V5- DEST)在8 μg·ml-1的Polybrene存在下進行高速離心和轉染培養(yǎng)，以未轉染的EPCs為對照，熒光顯微鏡下觀察轉染后熒光表達情況。

1.2.3 Western blotting檢測目的蛋白的表達

取對數(shù)期生長狀態(tài)良好、成功轉染CD基因的EPCs細胞，胰酶消化后加培養(yǎng)液制備成單細胞懸液，計數(shù)后溫箱培養(yǎng)2 d，取其培養(yǎng)上清液行Western blotting，檢測CD蛋白表達，僅轉染慢病毒的EPCs上清液和未轉染的EPCs上清液為對照組。

1.2.4 H22細胞體外抑制實驗

1.2.4.1 H22細胞培養(yǎng)及實驗分組 復蘇肝癌H22細胞株常規(guī)培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細胞胰酶消化后，用1640培養(yǎng)液制備成單細胞懸液計數(shù)后備用。利用Transwell小室共培養(yǎng)體系，將H22細胞均勻接種于Transwell上室(六孔板)，分別將轉染CD基因的EPCs(以下簡稱實驗組)、轉染空病毒的EPCs(以下簡稱空病毒組)、未轉染的EPCs(以下簡稱陰性對照組)單細胞懸液均勻加入Transwell下室，每組6孔，均設3個復孔。

1.2.4.2 CCK- 8法檢測CD/5- FC系統(tǒng)對H22細胞增殖的影響 將不同濃度的5- FC培養(yǎng)液分別加入含H22細胞的Transwell上室，5- FC濃度分別為20、60、80、100、120 mg·L-1，不加5- FC為對照組，放置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。96 h后Transwell上室每孔加入CCK8 10 μl繼續(xù)培養(yǎng)2 h，分別在酶標儀450 nm處讀取OD值，計算細胞生長抑制率(IR)，IR=(對照孔OD值-實驗孔OD值)/對照孔OD值×100%。

1.2.4.3 流式細胞術(FCM)檢測H22細胞凋亡情況 根據(jù)CCK- 8實驗結果，得出IR值大于50%的5- FC濃度為IC50。同CCK- 8法操作步驟，將H22細胞均勻接種于Transwell上室，將各組EPCs加入Transwell下室，最后將IC50濃度的5- FC加入Transwell上室，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h后取出上室中的H22細胞懸液加入2 ml圓底離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入PBS 1 ml離心洗滌，70%酒精固定，先后加入5 μl Annexin V- FITC、5 μl PI孵育30 min，混勻，過300目篩網(wǎng)，置流式管中，用流式細胞儀及ModFit軟件檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 鼠髓源性EPCs培養(yǎng)及鑒定

EPCs培養(yǎng)成功，14 d時倒置相差顯微鏡下可觀察到細胞生長呈鵝卵石狀(圖1)。熒光顯微鏡下培養(yǎng)細胞中均可見綠色熒光，胞核呈藍色，證實該細胞表達內(nèi)皮細胞特異性標記CD31和內(nèi)皮祖細胞標記KDR，為EPCs；培養(yǎng)細胞ac- LDL內(nèi)吞實驗及UEA- 1結合實驗陽性，超過90%的細胞為雙染陽性，進一步證實培養(yǎng)的絕大部分細胞為EPCs。鑒定結果圖參見已發(fā)表文獻[6]。

A.培養(yǎng)第7天時，細胞呈梭形 ×100；B.第14天時，細胞呈鵝卵石樣改變 ×200

圖1倒置相差顯微鏡下鼠髓源性EPCs形態(tài)學變化

Fig1MorphologyofEPCsderivedfrommicemarrow

2.2 目的基因轉染檢測

由于EGFP基因與CD基因為融合基因，CD基因轉染成功后的EPCs因含有綠色熒光蛋白，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，而未經(jīng)轉染的EPCs未顯示綠色熒光。見圖2。

2.3 目的蛋白的表達情況

Western blotting法判定標準：顯色后，內(nèi)對照β- actin條帶及CD蛋白條帶同時出現(xiàn)者為陽性結果，僅出現(xiàn)內(nèi)對照β- actin條帶者為陰性結果。鑒定結果如圖3顯示：轉染空病毒及未轉染的EPCs的上清液呈陰性結果，轉染CD基因的EPCs的上清液出現(xiàn)陽性結果，其有CD蛋白表達。

2.4 CCK- 8法檢測H22細胞增殖情況

96 h后測得的450 nm吸光度值(OD值)如圖4所示：與空病毒組和對照組不同，實驗組隨著5- FC濃度增加，OD值逐漸下降，在80、100、120 mg·L-1濃度下，實驗組OD值與對照組、空病毒組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但空病毒組各個濃度與對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。計算不同濃度的腫瘤細胞增殖抑制率，隨著5- FC濃度增加，實驗組細胞增殖抑制率逐漸增加，如圖5所示：5- FC濃度達到100 mg·L-1時，腫瘤細胞增殖抑制過半，約(54.74±5.38)%,即本實驗中5- FC的IC50為100 mg·L-1；而空載體組和對照組腫瘤增殖抑制相對極少。

A.未經(jīng)轉染的EPCs(倒置相差顯微鏡下);B.plenti6.3- EGFP- CD成功轉染的EPCs(熒光顯微鏡下)

圖2轉染成功的EPCs中CD基因的表達×100

Fig2ExpressionofCDgenetransfectedsuccessfully

A.未轉染的EPCs上清液;B.轉染空病毒的EPCs上清液;C.轉染CD基因的EPCs上清液

圖3Westernblotting鑒定CD蛋白表達

Fig3TheexpressionofCDproteintestedbyWesternblotting

2.5 流式細胞術檢測H22細胞凋亡

96 h后流式細胞術檢測結果顯示：實驗組細胞平均凋亡率為(48.71±4.62)%，空病毒組為(11.22±2.16)%，而對照組細胞自然凋亡率僅為(9.71±1.80)%，實驗組與空病毒組及對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，后兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。

3 討 論

新生血管的建立是惡性腫瘤得以不斷增殖和轉移的重要一步。文獻報道骨髓源性EPCs在腫瘤血管形成中的作用仍存在爭議[7]。其可通過潛在的旁分泌功能，分泌促血管生成因子，如VEGF、血管生成素- 1、SDF- 1及血管生成素- 2，間接參與和影響腫瘤新生血管形成[8- 9]。Massard等[10]研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)VEGFR2+骨髓源性EPCs在預測癌癥晚期病人死亡風險中具有重要價值。在肝癌研究領域，Shih等[11]發(fā)現(xiàn)肝癌細胞可增加骨髓源性EPCs的趨向性[12]。Yu與同事[13]的研究顯示，肝癌時腫瘤周圍相鄰組織微血管(adjacent non- tumor tissues，AT)與腫瘤血管(tumor vessels，TT)相比，募集了更多的EPCs，腫瘤周圍細胞所表達的血管生成因子如VEGF- A、bFGF、TGF- b、MCP- 1、TSP- 1、MMP- 9、TIMP- 2和內(nèi)皮抑素水平促進了EPCs的募集，提示腫瘤周圍微環(huán)境在肝癌術后腫瘤復發(fā)和轉移中起重要作用，而EPCs可能是肝癌輔助治療潛在的新載體或靶點。利用EPCs對富血管腫瘤的形成和發(fā)展的影響及趨化作用，可將其作為治療遞送載體，攜帶自殺基因、抗血管生成基因或腫瘤抑癌基因等殺死腫瘤細胞或抑制血管生成從而治療肝癌。Arafat等[14]首次提出了利用基因修飾EPCs，通過誘導進而殺傷腫瘤細胞。

與對照組比較，aP<0.05；與空病毒組比較，bP<0.05

圖4CD/5-FC系統(tǒng)作用下肝癌H22細胞增殖情況

Fig4EffectsofCD/5-FCsystemonproliferationofH22cells

圖5CD/5-FC系統(tǒng)對肝癌H22細胞株增殖抑制率

Fig5InhibitionproliferationrateofCD/5-FCsystemonH22celllines

A.對照組

B.空病毒組

C.實驗組

圖6CD/5-FC系統(tǒng)作用H22細胞96h的細胞凋亡情況

Fig6ApoptosisofH22cellstreatedwithCD/5-FCsystemfor96h

自殺基因作為治療惡性腫瘤的一種手段，近年來備受關注，其有一個突出的優(yōu)點是“旁觀者效應(bystander effect)”，即轉染細胞中的毒性藥物代謝物在殺傷自己的同時，還可通過不同的方式，造成其鄰近未轉染細胞的殺傷，因此可取得顯著的殺瘤效果。此現(xiàn)象產(chǎn)生考慮可能與縫隙連接、細胞凋亡、免疫介導、腫瘤缺血壞死等有關。利用自殺基因引起的“旁觀者效應”并結合EPCs作為治療遞送載體趨向肝癌細胞的特性，探索肝癌治療的研究越來越多[3]。自殺基因CD的表達蛋白即胞嘧啶脫氨酶可催化胞嘧啶脫氨基生成尿嘧啶，使無毒性的前藥5- 氟胞嘧啶(5- FC)轉變成高毒性的化療藥物5- 氟尿嘧啶(5- FU)。本實驗中，我們使用Transwell小室共培養(yǎng)體系，觀察不同濃度5- FC作用下小鼠肝癌H22細胞增殖變化，分析CD/5- FC系統(tǒng)體外抗腫瘤效果，其優(yōu)點是排除了CD/5- FC系統(tǒng)對于EPCs的殺傷作用和EPCs自然凋亡的影響，使腫瘤細胞增殖凋亡分析免受干擾。結果顯示，該系統(tǒng)在體外可顯著抑制肝癌H22細胞生長，誘導肝癌細胞凋亡，且與5- FC濃度效應有關，這為下一步體內(nèi)腫瘤實驗及模擬治療療程提供了理論基礎，但其具體分子生物學機制尚待更深一步研究。

該實驗也進一步證實了慢病毒載體作為轉基因的工具，具有高效轉導率和穩(wěn)定表達的特點[4]，且不會對實驗細胞及結果產(chǎn)生明顯影響，因而是目前體內(nèi)轉基因乃至基因治療較為合適的載體。同時，在轉基因系統(tǒng)觀察方法方面，我們采用熒光標記觀察。EGFP因帶有綠色熒光標志，可間接反映目的基因CD的表達，這樣可以很方便、快捷和較準確地直接在熒光顯微鏡下檢測基因轉導和表達情況。

雖然關于EPCs作為自殺基因載體治療肝細胞癌在臨床上的有效性及安全性還有待于進一步證實，但其對將來的肝癌抗腫瘤治療策略的價值是毋庸置疑的。本實驗組對自殺基因修飾內(nèi)皮祖細胞治療小鼠原位肝細胞癌的體內(nèi)研究尚在進行中。隨著各項生物信息技術的全面深入，我們?nèi)孕柽M一步探討與肝癌相關的基因治療的分子生物學機制及臨床可行性。

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