魏芹,金虹,任曉妹,蔣益波,劉乃豐

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210009; 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 心內(nèi)科,江蘇 南京 210009; 3.泰興市人民醫(yī)院 心內(nèi)科，江蘇 泰興 225400)

血管鈣化是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病和慢性腎病等疾病的共同病理基礎(chǔ),與許多臨床事件密切相關(guān)[1- 3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),血管鈣化是一個細(xì)胞介導(dǎo)的、類似于骨重構(gòu)的主動調(diào)節(jié)過程。正常狀態(tài)下,血管內(nèi)成骨成份和破骨成份處于平衡狀態(tài),抑制血管鈣化,病理狀態(tài)下這種平衡被打破。我們課題組前期研究表明,晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞鈣化,并在大鼠糖尿病血管鈣化模型基礎(chǔ)上證實AGEs促進(jìn)血管鈣化[4- 6]。本研究探討AGEs的主要成分羧甲基賴氨酸(CML)對單核細(xì)胞破骨樣轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

外周血來源于健康成人,CML購買自法國SAS多肽實驗室,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒、細(xì)胞核因子κ B受體活化因子配基(RANK- L)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M- CSF)均購自sigma公司,組織蛋白酶K抗體購自abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血單核細(xì)胞提取 無菌條件下抽取健康成人外周血,按照說明書,使用Ficoll液離心分離后吸取呈云霧狀的白膜層,離心棄上清液,加入α- MEM培養(yǎng)液重懸,調(diào)整單核細(xì)胞濃度為1×109L-1,接種于24孔培養(yǎng)板中,0.5 ml·孔-1,培養(yǎng)8 d。將細(xì)胞分為3組：30 ng·ml-1RANKL+25 ng·ml-1M- CSF誘導(dǎo)組(A組)，25 μg·ml-1CML+30 ng·ml-1RANK- L+25 ng·ml-1M- CSF干預(yù)組(B組)，空白對照組(C組)。

1.2.2 TRAP染色 染色方法按白細(xì)胞酸性磷酸酶試劑盒說明進(jìn)行,配制孵育液,細(xì)胞固定后在染液中37 ℃孵育60 min,鏡下觀察。對每培養(yǎng)孔6個隨機(jī)視野中的TRAP染色陽性的破骨樣細(xì)胞(胞核≥3)進(jìn)行計數(shù)。

1.2.3 Western blotting檢測組織蛋白酶K蛋白表達(dá) 培養(yǎng)8 d后提取細(xì)胞蛋白,經(jīng)10% SDS- PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后封閉1h,加入2 μg·ml-1稀釋的抗小鼠單克隆組織蛋白酶K抗體雜交,4 ℃過夜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ig G雜交,再洗膜顯色,圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化

培養(yǎng)3 d后,A組單核細(xì)胞出現(xiàn)融合趨勢,細(xì)胞體積變大,B組細(xì)胞融合現(xiàn)象較A組少,C組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量無明顯變化;8 d時B、C兩組出現(xiàn)少量的多核細(xì)胞,A組可見大量多核細(xì)胞,核的數(shù)目3～10個不等(圖1)。

2.2 TRAP染色結(jié)果

培養(yǎng)8 d時進(jìn)行TRAP染色,光鏡下可見胞漿呈紅色、胞核呈淡黃色的TRAP陽性破骨樣細(xì)胞。A組TRAP陽性破骨樣細(xì)胞數(shù)量較多,而B、C兩組陽性破骨樣細(xì)胞數(shù)量均相對較少(圖2)。

2.3 TRAP陽性多核細(xì)胞計數(shù)

光鏡下對各組TRAP陽性破骨樣細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。與C組比較,A組TRAP陽性破骨樣細(xì)胞數(shù)量明顯增多,而B組TRAP陽性破骨樣細(xì)胞數(shù)量較A組明顯減少(P<0.05)(圖3)。

2.4 組織蛋白酶K蛋白表達(dá)

Western blotting法檢測破骨樣細(xì)胞組織蛋白酶K蛋白表達(dá)量,以GAPDH為內(nèi)參。與C組相比,A組組織蛋白酶K蛋白表達(dá)明顯增加,而B組組織蛋白酶K蛋白表達(dá)較A組明顯降低(P<0.05)(圖4)。

3 討 論

傳統(tǒng)的動脈粥樣硬化的危險因素有高血壓、吸煙、高膽固醇血癥、超重/肥胖、糖尿病等,但實際上許多發(fā)生心血管事件的人并沒有這些因素。例如,約有一半的心肌梗死患者沒有危險因素或沒有冠心病史,許多婦女在心源性猝死之前往往沒有任何先兆。因此,尋找新的危險因素愈發(fā)顯得重要。近年血管生物學(xué)的研究和心血管影像學(xué)的進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)血管鈣化與許多臨床事件密切相關(guān)。因此,血管鈣化越來越受到人們的重視,血管鈣化的機(jī)制研究亦顯得非常重要。

A.培養(yǎng)3 d,A組出現(xiàn)細(xì)胞融合; B.培養(yǎng)8 d,A組出現(xiàn)大量破骨樣細(xì)胞; C.培養(yǎng)8 d,B組破骨樣細(xì)胞數(shù)量較A組明顯減少;D.培養(yǎng)8 d,C組出現(xiàn)少量破骨樣細(xì)胞

圖1光鏡下觀察單核細(xì)胞破骨樣轉(zhuǎn)化過程中形態(tài)變化×200

A. Some mononuclear cells fused togethe in group A at day 3 after induction; B. A large number of osteoclast- like cells were founded in group A at day 8 after induction; C. A little osteoclast- like cells were founded in group B at day 8 after induction; D. A little osteoclast- like cells were founded in group C at day 8 after induction

Fig1Morphologychangeofosteoclast-likecellsafterinduction×200

圖2破骨樣細(xì)胞化學(xué)染色鑒定(TRAP染色×200)

Fig2Tartrate-resistantacidphosphatase(TRAP)stainingresultsofinducedosteoclast-likecells×200

與C組比較,aP<0.05；與A組比較,bP<0.05

圖3CML抑制人外周血單核細(xì)胞向破骨樣轉(zhuǎn)化

Fig3CMLinhibitsRANKL-inducedosteoclastogenesisinhumanperipheralbloodmonocytes

與C組比較,aP<0.05;與A組比較,bP<0.05

圖4CML抑制破骨樣細(xì)胞組織蛋白酶K的蛋白表達(dá)

Fig4CMLsupressesproteinexpressionofCathepsinKinosteoclast-likecells

血管平滑肌細(xì)胞是血管鈣化的主要參與細(xì)胞。在血管鈣化形成過程中,血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣轉(zhuǎn)化被認(rèn)為起關(guān)鍵作用,當(dāng)前的研究也是聚焦在成骨樣轉(zhuǎn)化方面。但是近年來的研究發(fā)現(xiàn),血管鈣化是一個細(xì)胞介導(dǎo)的、類似于骨重構(gòu)的主動調(diào)節(jié)過程,正常狀態(tài)下,血管內(nèi)成骨成份和破骨成份處于平衡狀態(tài),抑制血管鈣化,病理狀態(tài)下這種平衡被打破。且已有研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化鈣化斑塊處確實存在破骨樣細(xì)胞證據(jù)。Jeziorska等[7]在動脈粥樣硬化鈣化斑塊處發(fā)現(xiàn)多核破骨樣細(xì)胞存在,但數(shù)量較少。Jaffer等[8]在動脈粥樣硬化鈣化斑塊處發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞標(biāo)志組織蛋白酶K。組織蛋白酶K為半胱氨酸蛋白酶家族的成員,是由成熟破骨細(xì)胞大量合成[9- 10],是破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因,可作為破骨細(xì)胞及其分化階段的標(biāo)志,這種酶在破骨細(xì)胞降解Ⅰ型膠原時發(fā)揮了關(guān)鍵作用,骨吸收陷窩中骨無機(jī)相的溶解是有機(jī)相退化的前提條件,而這個過程主要由組織蛋白酶K參與[10]。研究表明,促血管平滑肌細(xì)胞成骨化的因子,如氧化低密度脂蛋白膽固醇、高磷同時可抑制巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化[11- 12]。本研究從形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)CML能夠抑制外周血單核細(xì)胞向破骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,同時抑制了破骨細(xì)胞標(biāo)志基因組織蛋白酶K的表達(dá),表明糖基化終產(chǎn)物(AGEs)主要抗原表位CML能夠抑制單核細(xì)胞破骨樣轉(zhuǎn)化,這是AGEs促進(jìn)血管鈣化的又一個機(jī)制。本課題組將會通過在體水平深入研究CML對外周血單核細(xì)胞向破骨樣轉(zhuǎn)化的影響,為深入探討AGEs促進(jìn)血管鈣化新機(jī)制提供理論依據(jù)。

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