彭新桂，柏盈盈，居勝紅

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 放射科,東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 分子與功能影像實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210009)

研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織的體積和分布是多種疾病的重要致病因素之一。并且,脂肪組織中脂肪酸成分不同也是影響各種疾病的誘因,包括癌癥[1]、2型糖尿病[2]和心血管疾病[3]。然而,研究脂肪組織內(nèi)脂質(zhì)成分和疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系非常困難,部分原因是由于傳統(tǒng)有創(chuàng)的活檢限制了研究的開展。13C磁共振(13C- MR)波譜相對(duì)于磁共振氫質(zhì)子波譜(hydrogen magnetic resonance spectroscopy,1H- MRS),在檢測(cè)脂肪組織脂質(zhì)成分方面可以提供更多的特征[4- 5],但是13C- MR由于其相對(duì)低敏感性、低空間分辨率和相對(duì)高的技術(shù)要求而限制了其廣泛使用。并且,隨著高場(chǎng)強(qiáng)MR儀的廣泛應(yīng)用,1H- MRS的活體、非侵襲性測(cè)量脂質(zhì)及操作相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)有助于進(jìn)一步的研究[6]。ob/ob鼠是研究肥胖和糖尿病常用的動(dòng)物模型[7],本實(shí)驗(yàn)采用7.0 T MR成像儀對(duì)ob/ob及野生型(wild type,WT)小鼠進(jìn)行全身單次激發(fā)1H- MRS和單體素波譜采集,活體評(píng)價(jià)脂肪代謝異常ob/ob鼠及其野生對(duì)照組全身脂質(zhì)含量、不同類型脂肪組織脂質(zhì)成分。

1 材料與方法

1.1 材料

6只ob/ob(C57BL/OlaHsd- Lep)鼠購(gòu)買于北京軍事科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,雄性,10周齡,平均體重(47.5±1.54) g;6只對(duì)照組C57BL/6J鼠購(gòu)買于上海動(dòng)物模式中心,雄性,10周齡,平均體重(26±0.71) g;7.0 T小動(dòng)物MR成像儀(Bruker PharmaScan,德國(guó));異氟烷(山東科源制藥有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MR掃描

所有MR成像和1H- MRS采集均在7.0 T Micro MR成像設(shè)備上完成。所有小鼠MRI掃描期間均采用吸入麻醉,使用的吸入麻醉劑為異氟烷,與氧氣混合后誘導(dǎo)劑量為5%,維持劑量為1%～2%。小鼠頭先進(jìn)俯臥于內(nèi)徑3.5 cm鳥籠式發(fā)射與接受線圈內(nèi),同時(shí)連接呼吸門控監(jiān)視呼吸節(jié)律及幅度,呼吸頻率保持25～35次·min-1,并予保溫。所有動(dòng)物先后分別進(jìn)行MR成像及1H- MRS采集。

全身1H- MRS波譜采集使用單個(gè)RF脈沖序列,重復(fù)時(shí)間為5 000 ms,射頻脈沖持續(xù)時(shí)間為10 ms,重復(fù)次數(shù)為32。計(jì)算整體的甘油三脂(triglyceride,TG)含量按照下列公式：TG含量=TG峰下面積/(水峰下面積+TG峰下面積)×100%。

常規(guī)T1加權(quán)成像(T1WI)提供準(zhǔn)確的1H- MRS體素的定位。采用多層面多回波成像序列(multiple slices multiple echo, MSME),掃描參數(shù)： 重復(fù)時(shí)間為500.0 ms,回波時(shí)間為15.0 ms,翻轉(zhuǎn)角為180°,重復(fù)次數(shù)4次,無(wú)間距掃描。無(wú)脂肪抑制。成像范圍為從頸部至肛門,軸位掃描。

采集1H- MRS運(yùn)用點(diǎn)分辨自旋回波波譜技術(shù)(point- resolved echo spin spectroscopy,PRESS),重復(fù)時(shí)間和回波時(shí)間分別為2 500 ms和20 ms;體素為2.0 mm×2.0 mm×2.0 mm,重復(fù)次數(shù)為512。體素分別放置在棕色脂肪(brown adipose tissue,BAT)和白色脂肪(white adipose tissue,WAT),具體放置位置：BAT主要選擇頸肩部肩胛間區(qū)采集,WAT選擇下腹部生殖腺周圍,相應(yīng)部位位于磁場(chǎng)中心。均需避開大血管及邊緣部位。采集前先自動(dòng)勻場(chǎng),使被選體素區(qū)域磁場(chǎng)均勻性最優(yōu)化,在體波譜采集均不壓水,水峰半高寬<45 Hz。在Topspin軟件上將采集的自由感應(yīng)式衰減信號(hào)進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換,再將基線和相位矯正后進(jìn)行分析。波譜數(shù)據(jù)分析時(shí),首先確定4.7 ppm水峰為參考峰,將這個(gè)參考峰的峰下面積固定為1,所有其他峰的積分值都隨之標(biāo)準(zhǔn)化。按下列公式計(jì)算脂質(zhì)含量(FC)：FC=100%×B峰下面積 /(水峰下面積+B峰下面積)

TG峰為B峰,位于1.3 ppm,計(jì)算TG在總體氫質(zhì)子中所占百分比。水峰的化學(xué)位移為4.6～4.8 ppm,TG峰的化學(xué)位移為1.2～1.4 ppm，計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[8]。

分別計(jì)算飽和脂肪酸(fraction of saturated fatty acids,FS)、不飽和脂肪酸(fraction of unsaturated fatty acids,FU)、雙不飽和脂肪酸(fraction of diunsaturated fatty acids,FDU)含量及多聚不飽和程度(polyunsaturation degree,PUD),A峰的化學(xué)位移為0.8～1.0 ppm,D峰的化學(xué)位移為1.9～2.1 ppm,E峰的化學(xué)位移為2.1～2.3 ppm,F峰為2.7～2.9 ppm，計(jì)算公式如下[8- 9]：FU=D峰下面積/(2×E峰下面積);FS=1-FU;FDU=F峰下面積/E峰下面積;PUD=F峰下面積/(2/3)A峰下面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 整體1H- MRS測(cè)量TG含量

單次激發(fā)1H- MRS可以在活體上整體定量脂質(zhì)蓄積程度。全身波譜顯示兩個(gè)峰：一個(gè)水峰在4.7 ppm,一個(gè)是TG峰在1.3 ppm。ob/ob鼠TG氫質(zhì)子含量占總體氫質(zhì)子含量的52.93%±3.66%,而WT鼠為7.88%±0.79%,ob/ob鼠顯著高于WT鼠,兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1)。

圖1全身單次激發(fā)1H-MRS波譜圖及全身TG含量比較

Fig11H-MRSofallbodywithasingleradiofrequencypulsesequence

2.2 單體素1H- MRS定量WAT及BAT的脂質(zhì)含量及成分分析

分別采集分析頸肩部BAT及生殖腺周圍WAT的1H- MRS(圖2)。ob/ob鼠和WT鼠BAT的脂質(zhì)含量分別為93.1%±1.6%、74.4%±1.6%;兩組鼠WAT的脂質(zhì)含量分別為95.6%±1.6%、90.7%±4.8%,測(cè)量結(jié)果顯示ob/ob鼠BAT的脂質(zhì)含量顯著高于WT鼠(P<0.05),但是兩組鼠WAT的脂質(zhì)含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。HE染色結(jié)果顯示,WT鼠BAT脂肪細(xì)胞較小,血管豐富,而ob/ob鼠BAT脂肪細(xì)胞內(nèi)見多量脂滴,較WT鼠脂肪細(xì)胞體積明顯增加,血管較稀疏;兩者WAT形態(tài)基本一致,但是ob/ob鼠WAT細(xì)胞較WT鼠體積明顯增大(圖3)。

圖21H-MRS采集BAT和WAT體素放置位置(A)及波譜圖(B)

Fig2Thevoxelof1H-MRSinBATandWAT

Tab 1 The lipid contents of the BAT and WAT in vivo by MRI and %

ob/ob鼠WAT的PUD低于野生對(duì)照組,分別為0.236±0.043和0.309±0.043(P<0.05);ob/ob鼠WAT的FDU也低于對(duì)照組,分別為0.211±0.023和0.297± 0.035(P<0.05),但是ob/ob鼠WAT的FU與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),ob/ob鼠BAT的PUD、FU及FDU與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

ob/ob鼠WAT的FDU低于BAT的FDU,分別為0.211±0.023和0.249±0.048,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ob/ob鼠WAT與BAT的PUD分別為0.236±0.043、0.272±0.063,FU分別為0.774±0.063、0.743±0.069,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。WT鼠WAT的FU高于BAT,分別為0.789±0.063和0.681±0.039,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);WT鼠WAT與BAT的PUD及FDU間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

圖3BAT及WAT的HE染色結(jié)果×200

Fig3HEstainingofBATandWAT×200

表2WAT和BAT活體1H-MRS脂肪成分分析(n=6)

Tab2ThelipidcomponentanalysisinBATandWATinvivobyusing1H-MRS(n=6)

鼠 別WATBATPUDFUFDUPUDFUFDUob/ob鼠0.236±0.0430.774±0.0630.211±0.0230.272±0.0630.743±0.0690.249±0.048aWT鼠0.309±0.0430.789±0.0630.297±0.0350.341±0.0680.681±0.039a0.262±0.053t值-3.453-0.496-6.574-1.6701.713-0.392P值0.0030.6250.0000.1330.1300.705

與WAT比較,aP<0.05

3 討 論

3.1 單次激發(fā)1H- MRS評(píng)價(jià)小鼠全身脂質(zhì)含量

脂肪組織分布全身,受性別、年齡、飲食、體育鍛煉、激素及藥物[10]等因素影響,同時(shí),脂肪分布的部位不同引起心血管風(fēng)險(xiǎn)因素的關(guān)聯(lián)度顯著不同[11]。ob/ob鼠純合子缺乏瘦素mRNA的表達(dá)導(dǎo)致無(wú)義突變,從而引起無(wú)活性的瘦素增加。瘦素在調(diào)節(jié)體重、脂肪沉積及能量代謝方面均發(fā)揮重要作用,除了在能量?jī)?chǔ)備上起非常重要的作用外,在調(diào)節(jié)脂肪酸及葡萄糖代謝上也起關(guān)鍵作用[12- 13]。脂肪組織單次激發(fā)1H- MRS使活體非侵襲性整體定量研究脂質(zhì)累積程度成為可能,檢測(cè)結(jié)果顯示ob/ob鼠TG含量顯著高于WT鼠。研究也證實(shí),在MRI上測(cè)量全身WAT體積,結(jié)果表明ob/ob鼠顯著高于正常對(duì)照組[6,9]。該方法測(cè)量全身脂質(zhì)含量比整體光密度測(cè)量法或同位素測(cè)量法更簡(jiǎn)便易行,可以成為評(píng)價(jià)肥胖的一個(gè)敏感指標(biāo)[14]。

3.2 單體素1H- MRS評(píng)價(jià)WAT及WAT脂質(zhì)含量及脂質(zhì)成分

根據(jù)脂肪組織的不同功能和顏色分為WAT和BAT。WAT的主要功能是以TG形式儲(chǔ)存能量,在食物不足時(shí),為了代謝需要?jiǎng)訂T儲(chǔ)存的TG。而 BAT的主要功能是能量消耗和產(chǎn)熱[15]。形態(tài)學(xué)上,WAT細(xì)胞內(nèi)含有單一大脂滴,而BAT細(xì)胞是多房腔的,包含多重脂滴。BAT不同于WAT，含有豐富的血管和神經(jīng)支配。BAT由于含有豐富的血管和稠密的線粒體而呈棕色。在寒冷誘導(dǎo)下,BAT快速上調(diào)解耦連蛋白Ucp1活力,促使BAT細(xì)胞質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)和分解ATP產(chǎn)生熱能。在小型哺乳動(dòng)物,BAT活力受損被認(rèn)為在脂肪代謝異常和代謝綜合征中起重要作用。同時(shí),WAT和BAT都含有調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成、水解和分泌激素的酶類,例如瘦素,調(diào)節(jié)能量動(dòng)態(tài)平衡。因而活體檢測(cè)WAT及BAT變化顯得尤為重要[16]。

在胚胎形成第15天,在肩胛間區(qū)BAT結(jié)構(gòu)就已形成,而WAT在出生后形成,主要位于腹股溝、腹膜后、性腺、腸系膜和皮下。頸部及肩胛間區(qū)在解剖上是BAT組織的分布范圍,由于ob/ob鼠與WT鼠的BAT的血管含量及脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴不一致,單體素MRS方法測(cè)量BAT中脂肪和水的含量也不同,ob/ob鼠與WT鼠BAT的脂肪含量分別為93%和74%,ob/ob鼠BAT脂肪含量顯著高于WT鼠,組織病理學(xué)上也證實(shí)ob/ob鼠BAT脂肪細(xì)胞內(nèi)存留大量的脂滴,脂肪細(xì)胞明顯增大,而WT鼠BAT脂肪細(xì)胞小,存儲(chǔ)的脂滴少,血管豐富。但是WT鼠頸部及肩胛間區(qū)BAT體積較小,MRS的體素內(nèi)可能包含周圍肌肉等其他組織而影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

單體素1H- MRS在7.0 T場(chǎng)強(qiáng)下能夠采集化學(xué)位移0.9～5.3 ppm范圍內(nèi)10個(gè)峰,可以計(jì)算FS、FU、FDU含量及PUD。單體素1H- MRS體外實(shí)驗(yàn)研究[17]表明,測(cè)量100%油的FS及FU相對(duì)含量,分別為0.15和0.85,與實(shí)際脂肪成分?jǐn)?shù)據(jù)一致(脂肪100%, FS 15 g, FU 85 g);同時(shí)測(cè)量PUD為0.03,這對(duì)應(yīng)用于活體進(jìn)行脂肪的定性研究非常重要,其不同的含量有著不同的病理生理意義：不同的脂肪代謝異常情況下脂肪組織FS及FU的相對(duì)含量會(huì)發(fā)生改變;不同脂肪組織如WAT和BAT的PUD也有不同,并且在生理狀態(tài)下,PUD還受年齡、飲食及生存環(huán)境等因素影響。ob/ob鼠和WT鼠的內(nèi)臟WAT組織的PUD分別為0.24和0.31。Calderan等[9]測(cè)量ob/ob鼠皮下WAT的PUD,結(jié)果為0.524 7;而Lanati等[18]測(cè)量WT大鼠皮下WAT的PUD為0.68。由此證實(shí),PUD受不同類型、不同部位脂肪組織、不同品系等多種因素影響。文獻(xiàn)[19]報(bào)道,1H- MRS測(cè)量皮下脂肪組織中FS為27%～29%,FDU為23%～24%,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示內(nèi)臟WAT和BAT FS為21%～32%,FDU為21%～28%,并且顯示ob/ob鼠WAT FDU高于WT鼠,ob/ob鼠WAT FDU高于BAT。Ren等[19]利用活檢組織氣相色譜分析(金標(biāo)準(zhǔn))檢測(cè)人皮下及骨髓脂肪組織FDU的含量為17%～18%,而波譜測(cè)量結(jié)果為23%～24%,較金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果高估?？赡艿脑蛑饕幸韵?個(gè)：(1) 大分子或含水代謝產(chǎn)物的化學(xué)位移與脂質(zhì)的化學(xué)位移有所重疊;(2) 幾種不同脂肪酸的活體氫質(zhì)子波譜信號(hào)有輕度不同化學(xué)位移;(3) T2矯正是非常關(guān)鍵的,甚至比T1矯正更為重要。所以,1H- MRS需要進(jìn)一步改善采集及后處理方法。

單次激發(fā)全身1H- MRS及單體素1H- MRS不僅可以實(shí)現(xiàn)活體觀察全身脂質(zhì)含量及脂肪組織脂質(zhì)含量,也可以分析不同脂肪組織中脂質(zhì)成分的動(dòng)態(tài)變化,7.0 T1H- MRS因其簡(jiǎn)單、快速、無(wú)創(chuàng)、無(wú)痛等優(yōu)點(diǎn)成為進(jìn)一步研究脂質(zhì)代謝的新方法。

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