彭新桂,柏盈盈,居勝紅

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 放射科,東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 分子與功能影像實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210009)

下肢缺血性疾病是由動脈狹窄或閉塞而引起的一系列疾病,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至危及生命。在70歲以上人群,外周動脈疾病的發(fā)病率約20%。藥物治療效果非常有限,外科及血管腔內(nèi)治療的長期療效并不滿意。治療性的血管新生被認(rèn)為是可供選擇的治療方法之一[1]。在過去的20多年,生長因子及細(xì)胞療法已經(jīng)被用來促進(jìn)缺血下肢的血管新生[1- 2],從而促進(jìn)組織的有效灌注和預(yù)防組織壞死及截肢。目前越來越多的干細(xì)胞移植治療為下肢缺血性疾病帶來了新的希望。為了進(jìn)一步研究的需要,建立穩(wěn)定有效的動物缺血模型顯得尤為重要。在本研究中,我們制作了電凝法小鼠下肢缺血模型,并通過Micro- CT、超聲、活體近紅外光譜儀及小動物磁共振等方法對該模型進(jìn)行血管閉塞平面、血流、組織缺血損傷、組織血氧飽和度及組織病理學(xué)等方面的全面評價。

1 材料與方法

1.1 材料

裸鼠(4～6周齡,體重14～18 g,SPF級,上海模式動物中心),體視顯微鏡(ZOOM6455,江南禹成光學(xué)),高頻電刀(雙極電凝器GD350- S3,雙極鑷子直徑為0.3 mm,上海滬通電子有限公司),眼科鑷(系線鑷- 直平臺0.12 mm,系線鑷- 彎平臺0.3 mm,蘇州明仁醫(yī)療器械公司);眼科剪(蘇州明仁醫(yī)療器械公司);硫酸鋇混懸液(福建梅生藥業(yè)),活體成像系統(tǒng)：IVIS Lumina XR生物發(fā)光、熒光、X光三合一小動物成像系統(tǒng)(冷泉港生物科技股份有限公司,臺灣),Micro- CT(MCT- 1108,蘇州和君科技發(fā)展有限公司)，B型超聲儀，7.0 T 小動物磁共振成像儀(Bruker PharmaScan,德國)，近紅外激光光譜儀(南京航空航天大學(xué)錢志余教授團(tuán)隊(duì)自行研發(fā))，異氟烷(山東科源制藥有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠下肢缺血模型的制作[3]

所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)東南大學(xué)動物倫理委員會同意。為了進(jìn)一步研究下肢缺血的細(xì)胞移植治療,選用的小鼠為裸鼠。腹腔注射1 mg·ml-1戊巴比妥鈉(小鼠每10 g體重0.03 ml)麻醉成功后,將裸鼠仰臥位,并將裸鼠四肢及門牙固定。右側(cè)腹股溝區(qū)局部酒精消毒后用眼科剪剪開右側(cè)腹股溝區(qū)皮膚,在體視顯微鏡下(放大倍數(shù)3～5倍)小心分離皮下脂肪層和筋膜,暴露髂外動脈遠(yuǎn)端及股動脈起始處、股靜脈及股神經(jīng),用直型眼科鑷小心分離髂外動脈起始部和股動脈,并小心將靜脈和神經(jīng)分開;用彎型眼科鑷挑起髂外動脈,于髂外動脈遠(yuǎn)端股動脈起始處用高頻電刀(功率為25 W)電凝中斷血流,依次分離股動脈和腘動脈并電凝,術(shù)中操作需要非常小心保護(hù)靜脈和神經(jīng),避免靜脈血管破裂出血或電凝中斷,一旦靜脈及神經(jīng)受損則該模型淘汰?？p皮后結(jié)束手術(shù)，注意保暖直至蘇醒。

1.2.2缺血模型的評價方法

1.2.2.1 大體觀察 模型制作完成后觀察雙側(cè)下肢皮膚的顏色及運(yùn)動功能。

1.2.2.2 X線成像 裸鼠下肢缺血模型制作后24 h內(nèi),2 mg·ml-1戊巴比妥鈉過量麻醉小鼠。醫(yī)用硫酸鋇混懸液配制成鋇水濃度為100%。剪開胸腔暴露心臟,眼科鑷于右心房剪一小口,從左心室注射濃度為100%的硫酸鋇溶液0.5～1.0 ml,觀察右心房流出白色硫酸鋇后立即停止注射,置于X線機(jī)下投照,投照體位為盆腔及雙側(cè)下肢正位、左右斜位。掃描參數(shù)：35 kV, 100 μA,曝光時間60 s。

1.2.2.3 Micro- CT成像 X線成像結(jié)束后立即進(jìn)行Micro- CT掃描。掃描參數(shù)：60 kV,70 μA,層厚0.05 mm。三維重建軟件為3 D Slicer。

1.2.2.4 B型超聲 裸鼠下肢缺血模型制作后24 h內(nèi),麻醉小鼠后對雙側(cè)下肢肌肉進(jìn)行超聲探查,觀察雙側(cè)下肢肌肉的動脈血流改變。

1.2.2.5 磁共振成像 所有MRI采集均在7.0 T Micro MR成像設(shè)備上完成。所有小鼠MRI掃描期間均采用吸入麻醉,使用的吸入麻醉劑為異氟烷,與氧氣混合后誘導(dǎo)劑量為5%,維持劑量為1%～2%。小鼠頭先進(jìn)仰臥位于內(nèi)徑3.5 cm鳥籠式發(fā)射與接受線圈內(nèi),同時連接呼吸門控監(jiān)視呼吸節(jié)律及幅度,呼吸頻率保持25～35次·分-1,并予以水暖系統(tǒng)保溫。

T2加權(quán)成像(T2weighted imaging,T2WI)脂肪抑制成像采用弛豫增強(qiáng)序列快速采集,掃描參數(shù)： TR=3 000.0 ms,TE=36.0 ms,FA=180°,NEX=4,FOV=3.5 cm×3.5 cm×3.5 cm,MTX=256×256×256,層厚1 mm,無間距掃描。圖像分析采用Image J軟件,測量小腿高信號水腫及液化壞死區(qū)域。T2mapping采用多回波成像序列,掃描參數(shù)為TR=2 500 ms, TE=11～176 ms 共 16 回波,回波間隔時間為11 ms。

彌散加權(quán)成像(diffusion weighted imgaging,DWI)采用自旋回波DWI序列,具體掃描參數(shù)為：TR=2 500 ms,TE=30 ms,b值為50、100、200、300、400、500、550、600 s·mm-2,FOV=3.5 cm×3.5 cm×3.5 cm,MTX=256×256×256,層厚1 mm。圖像分析采用Image J軟件,測量小腿高信號水腫及液化壞死區(qū)域。

1.2.2.6 活體近紅外激光光譜 應(yīng)用近紅外激光光譜儀[4- 5]分別測量缺血側(cè)和非缺血側(cè)下肢肌肉的血氧飽和度。具體操作方法為：調(diào)試系統(tǒng)后,濃度為1 mg·ml-1戊巴比妥鈉麻醉小鼠,仰臥位固定小鼠,剪開雙側(cè)下肢內(nèi)側(cè)和外側(cè)皮膚長約2 mm,注意不要破壞皮下血管,輕輕挑起皮膚,將定標(biāo)后的微創(chuàng)光纖探頭(100 μm)安裝在固定調(diào)節(jié)儀上,光纖探頭位于皮下肌肉組織上,每個部位采集240個點(diǎn),每個點(diǎn)0.5 s，取其均值為該處的測量值。

1.2.2.7 組織病理切片HE染色 斷頸處死裸鼠后,生理鹽水及4%多聚甲醛前后心臟灌流后取出缺血側(cè)及正常側(cè)下肢肌肉。組織常規(guī)石蠟包埋,切片厚度為5 μm,進(jìn)行蘇木素- 伊紅(Hematoxylin & Eosin,HE)染色和Masson 染色,HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變,Masson染色主要觀察存活肌纖維。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件包處理所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),求出缺血側(cè)及正常側(cè)下肢肌肉內(nèi)各觀察指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,用配對t檢驗(yàn)比較定量指標(biāo)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠下肢缺血模型的評價

裸鼠下肢缺血模型制作后, 大體病理觀察右下肢皮膚膚色蒼白,蘇醒后行走呈跛行。X線(圖1A)、Micro- CT(圖1B)顯示右側(cè)髂外動脈遠(yuǎn)端及股動脈起始處閉塞,腹壁動脈及其他小動脈均未見顯示。彩色多普勒超聲(圖1C)顯示缺血側(cè)下肢肌肉內(nèi)的動脈血流信號較正常側(cè)顯著下降。

圖1外科術(shù)后X線(A)、MicroCT(B)及彩色多普勒超聲(C)評價下肢缺血模型

Fig1MousemodelofhindlimbischemiaassessmentbyusingX-ray,MicroCTandultrasound

2.2 磁共振評價下肢缺血后肌肉組織變化

在T2WI上顯示缺血側(cè)下肢肌肉較正常側(cè)信號明顯增高(圖2A),正常側(cè)肌肉T2弛豫時間為(28.88±2.01) ms,缺血側(cè)T2弛豫時間顯著延長(圖2B),為(52.53±2.32) ms;同時DWI也顯示缺血側(cè)肌肉信號增高(圖2C),配對t檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.825,P<0.0001)。同時測量缺血側(cè)肌肉的ADC值為(1 457.50±58.50) mm2·s-1,而正常肌肉的ADC值僅為(1 067.25±48.34) mm2·s-1,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.045,P=0.004，圖2D)。

2.3 近紅外激光光譜評價缺血下肢肌肉組織血氧飽和度變化

裸鼠正常側(cè)下肢肌肉組織的血氧飽和度為63.85%±17.28%,缺血側(cè)下肢肌肉組織的血氧飽和度顯著低于正常側(cè),為32.83%±3.01%,配對t檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.379,P=0.001)。裸鼠正常側(cè)下肢肌肉組織的脫氧血紅蛋白含量為(102.16±47.87) μmol·L-1,缺血側(cè)下肢肌肉組織的脫氧血紅蛋白含量為(181.01±19.88) μmol·L-1,顯著高于正常側(cè),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.736,P=0.007)。相反,裸鼠正常側(cè)下肢肌肉組織的含氧血紅蛋白含量為(188.11±62.34) μmol·L-1,缺血側(cè)下肢肌肉組織的脫氧血紅蛋白含量為(87.95±6.86) μmol·L-1,顯著高于正常側(cè),配對t檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.578,P<0.001)。見圖3。

A為T2WI,缺血側(cè)下肢肌肉信號顯著高于正常側(cè);B顯示缺血側(cè)肌肉T2弛豫時間顯著高于正常側(cè);C為DWI,缺血側(cè)下肢肌肉信號也顯著高于正常；D顯示缺血側(cè)肌肉ADC值高于正常；aP<0.001,bP<0.01

圖2下肢肌肉組織磁共振T2加權(quán)成像及彌散加權(quán)成像及定量測量

Fig2TherepresentationT2WIanddiffusionweightedimagingandquantitationofhindlimbischemiamuscle

A.近紅外激光光譜儀測量系統(tǒng)，1為鹵素光源(HL- 2000,Ocean Optics Inc. Dunedin, FL)，2為USB纖維光學(xué)波譜計(USB2000, Ocean Optics Inc.)，3為Y型纖維光學(xué)探頭(直徑為100 μm)，4為纖維探頭的橫截面，5為計算機(jī)及軟件，6為電動步進(jìn)器(MID- 7604 National Instruments)，7為電動步進(jìn)器控制儀(PCI- 7344)；B.小鼠下肢缺血側(cè)及正常側(cè)肌肉組織血氧飽和度,缺血側(cè)顯著低于正常側(cè);C.小鼠下肢缺血側(cè)及正常側(cè)肌肉組織含氧及脫氧血紅蛋白含量;aP<0.01,bP<0.001

圖3近紅外激光光譜測量小鼠下肢肌肉組織血氧飽和度及血紅蛋白含量

Fig3Theoxygensaturationandtheoxyhemoglobinorhemog-lobincontentinhindlimbischemiamusclebyusingNIRS

2.4 組織病理學(xué)評價肌纖維變化

HE染色顯示正常下肢肌纖維呈多角形,肌纖維間存在一定的間隙,缺血下肢肌纖維顯著腫脹、變圓,肌纖維間隙明顯變窄。Masson染色顯示正常肌纖維呈鮮紅色,缺血下肢鮮紅色肌纖維基本消失,取而代之是肌纖維失活后呈綠色。見圖4。

圖4肌肉組織病理學(xué)HE(×200)和Masson(×25)染色結(jié)果

Fig4Histopathologyoftheischemiamuscletissue

3 討 論

小鼠下肢缺血模型的制作方法主要有以下兩種方法:一是下肢缺血再灌注模型,短暫缺血后開通血管,同時刺激組織增加血流量導(dǎo)致再灌注損傷[5];其次為下肢動脈結(jié)扎法[3]、電凝法[7]或介入栓塞[8]等方法,主要表現(xiàn)為動脈供應(yīng)的急性永久中斷。缺血再灌注對不同類型肌纖維的損傷是不一致的,有研究證實(shí)缺血后Ⅱ型肌纖維更易受損[9]。所以下肢缺血再灌注模型用于研究該差異,同時研究下肢缺血性疾病血管內(nèi)治療后引起的再灌注損傷也應(yīng)該選擇該模型。采用介入栓塞法制作持續(xù)性下肢缺血模型優(yōu)點(diǎn)非常多,微創(chuàng)、避免開放手術(shù)引起的炎癥反應(yīng)及傷口愈合、并模擬人體病理改變,但是應(yīng)用于小鼠下肢缺血模型的制作非常困難,文獻(xiàn)中報道最小動物為大鼠[8]。因此,小鼠下肢缺血模型的制作方法主要采用結(jié)扎法和電凝中斷法。電凝法對手術(shù)操作者要求更高,并且對器材要求更高,需要準(zhǔn)備更細(xì)的電凝刀。但是兩種方法制備的缺血模型并無本質(zhì)不同。缺血后骨骼肌纖維能夠存活約4 h,延長缺血時間將進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷。在研究肌纖維重建及血管再生或血管新生方面[3],將更多地選用持續(xù)性缺血動物模型。

通常血管造影是評價小鼠下肢缺血模型建立成功的金標(biāo)準(zhǔn)。但是活體小鼠股動脈導(dǎo)管插入后動態(tài)造影顯得非常困難。為了評價下肢缺血模型動脈中斷的平面,本實(shí)驗(yàn)采用稀釋硫酸鋇進(jìn)行小鼠心臟灌注后,立即進(jìn)行X線及Micro- CT掃描,均證實(shí)該模型缺血平面位于股動脈起始平面。

MRI技術(shù)提供一種無創(chuàng)評價下肢肌肉病理生理進(jìn)程的方法。下肢缺血后肌肉T2WI上信號增高通常是由于組織損傷造成的,肌肉T2弛豫時間的變化反映了一系列組織病理過程,包括水腫、炎癥及壞死。但是T2弛豫時間并不能提供更進(jìn)一步的信息。DWI反映的是水分子的運(yùn)動,缺血損傷后肌肉組織內(nèi)由于細(xì)胞膜等屏障作用,導(dǎo)致水分子彌散受限,并且相對于T2WI,DWI能更早反映組織損傷[10]。本研究顯示下肢缺血4～6 h后,組織T2弛豫時間及ADC均顯著增高。同時組織病理HE染色顯示缺血肌纖維明顯腫脹,肌纖維間隙明顯變窄,所以導(dǎo)致DWI呈高信號,反映水分子彌散受限。

近紅外激光光譜技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種檢測組織結(jié)構(gòu)性質(zhì)和動態(tài)功能的方法[11]。該技術(shù)的理論基礎(chǔ)是,由于吸收和散射的作用,光在通過組織后其強(qiáng)度會減小,削減的程度與所通過組織的吸收系數(shù)和優(yōu)化散射系數(shù)的大小有關(guān),因此可以說漫反射或透射光中攜帶著大量的生物組織結(jié)構(gòu)和成分的信息,從漫反射或透射光的光譜信息中了解光在這種組織中被吸收和散射的情況,從而計算出組織的吸收系數(shù)和優(yōu)化散射系數(shù)等光學(xué)參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用光纖埋入微創(chuàng)探頭測試靶點(diǎn)位置的光學(xué)參數(shù)及其組織光譜學(xué)指標(biāo),并且具有微創(chuàng)在位測量、設(shè)備成本低、檢測光的返回信息量大等優(yōu)點(diǎn)[12]。本實(shí)驗(yàn)顯示缺血肌肉脫氧血紅蛋白含量高于正常肌肉,含氧血紅蛋白含量降低,缺血肌肉的血氧飽和度顯著低于正常肌肉。同時彩色多普勒超聲進(jìn)一步證實(shí)缺血肌肉內(nèi)血流量顯著減少。

本實(shí)驗(yàn)制備的電凝法小鼠下肢缺血模型,大體病理可觀察到缺血下肢皮膚顏色蒼白,X線及Micro- CT均顯示動脈中斷平面位于股動脈起始處,彩色多普勒超聲及近紅外激光光譜證實(shí)缺血肌肉的血流量及血氧飽和度均顯著下降,MRI顯示缺血肌肉水腫及水分子彌散受限,上述實(shí)驗(yàn)均證明該模型成功構(gòu)建,為進(jìn)一步研究下肢缺血性疾病的治療方法及相關(guān)機(jī)制提供了穩(wěn)定模型。

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