楊 雪，劉 潔，吳曉明，徐進(jìn)宜

中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，南京 210009

隨著生命科學(xué)的迅猛發(fā)展，氣體小分子在生命活動(dòng)中的意義受到越來(lái)越多的關(guān)注。伴隨著氣體信號(hào)分子NO和CO的發(fā)現(xiàn)，Wang等[1]在2002年又發(fā)現(xiàn)了第三種新型氣體信號(hào)分子，即H2S氣體信號(hào)分子。研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度下的H2S分子參與體內(nèi)多個(gè)生理環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)，尤其在高血壓、肺動(dòng)脈高壓、帕金森、阿爾茲海默等疾病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

1 內(nèi)源性H2S的合成與代謝

1.1 H2S的體內(nèi)合成過(guò)程

H2S是一種無(wú)色，易燃，具有臭雞蛋氣味的氣體分子。在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)，它的內(nèi)源性合成以L(fǎng)-半胱氨酸為底物，主要依賴(lài)于兩種5’-磷酸吡哆醛依賴(lài)性酶，胱硫醚-β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γlyase，CSE）[2]。這兩種酶的分布具有組織特異性:CBS主要催化腦組織以及神經(jīng)組織內(nèi)H2S的生成，并在肝臟和腎臟中高度表達(dá)；CSE主要在肝臟以及血管/非血管平滑肌中高度表達(dá)，并且在嚙齒類(lèi)動(dòng)物的小腸以及胃中也檢測(cè)到低濃度的CSE[2-3]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在線(xiàn)粒體中，巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-mercaptopycurate sulfurtransferase，3MST）也可以催化半胱氨酸生成 H2S[4]（見(jiàn)圖 1）。Shibuya等[5]在 2012 年發(fā)現(xiàn)在小腦和腎臟中，D-半胱氨酸可以在氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAO）和巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移 酶（3-mercaptopyruvate sulphur transferase，3-MST）的作用下生成H2S。

1.2 體內(nèi)H2S的代謝過(guò)程

體內(nèi)生成的H2S有1/3以氣體形式存在，另外2/3則以NaHS的形式存在，并且兩者處于一種動(dòng)態(tài)平衡。H2S在體內(nèi)的主要代謝途徑是經(jīng)氧化代謝形成硫酸鹽。在代謝過(guò)程中體內(nèi)的硫化物先轉(zhuǎn)化為硫代硫酸鹽，再經(jīng)硫代硫酸鹽還原酶或硫代硫酸鹽硫基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為亞硫酸鹽，亞硫酸鹽在谷胱甘肽的參與下氧化為硫酸鹽，從腎臟排出。另外少部分硫化物則代謝為蛋白加合物，經(jīng)甲基化代謝而形成毒性較低的甲硫醇和甲硫醚[6]（見(jiàn)圖1）。

2 外源性H2S供體類(lèi)型

如圖2所示，外源性的H2S供體主要包括7種類(lèi)型:（1）Na2S、NaHS、CaS 等含硫化鹽[7-8]；（2）勞森試劑（二硫代磷酸酯類(lèi)）衍生物（如 GYY4137）[9]；（3）天然產(chǎn)物中大蒜素類(lèi)（如二烯丙基三硫化物（DATS））[10]；（4）二硫代硫酮類(lèi)衍生物（如去甲茴三硫）[11]；（5）N-（苯甲?；?硫代苯甲酰胺類(lèi)衍生物[12]；（6）S-乙?；^(guò)硫類(lèi)化合物[13]；（7）硫代氨基酸類(lèi)化合物[14]。

3 H2S的主要生理活性

3.1 血管擴(kuò)張活性

圖1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中H2S生成與代謝過(guò)程

圖2 7種外源性H2S供體類(lèi)型

原發(fā)性高血壓患者中存在同型半胱氨酸和H2S的代謝不平衡，經(jīng)治療的高血壓患者組的血漿H2S濃度明顯低于正常對(duì)照組。在經(jīng)治療的高血壓患者中，隨著血壓水平的增加，H2S水平均逐漸降低，三級(jí)高血壓水平患者的H2S濃度均明顯低于血壓控制良好者，該研究結(jié)果表明H2S在高血壓的發(fā)生和發(fā)展中均具有重要作用[15]。

敲除小鼠的CSE基因會(huì)導(dǎo)致血漿、心臟、主動(dòng)脈條等組織內(nèi)H2S濃度的顯著下降，進(jìn)而引起小鼠內(nèi)皮依賴(lài)的擴(kuò)血管活性下降，血壓出現(xiàn)明顯上升[4]。Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)H2S通過(guò)開(kāi)放血管平滑肌細(xì)胞ATP敏感的鉀通道（KATP）使收縮的血管呈濃度依賴(lài)性舒張。當(dāng)靜脈推注H2S會(huì)使大鼠血壓出現(xiàn)12～30 mmHg的短暫下降，該降血壓活性類(lèi)似吡那地爾（KATP開(kāi)放劑），并可被格列本脲（KATP阻滯劑）拮抗。為進(jìn)一步確定H2S對(duì)KATP通道的作用，研究者采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞以300 μm的H2S孵育后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KATP通道電位峰值和時(shí)程寬度顯著增大。KATP通道對(duì)細(xì)胞總電流的增加會(huì)直接引起細(xì)胞膜的超極化，進(jìn)而松弛血管平滑肌。其后對(duì)一組細(xì)胞進(jìn)行同樣監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)H2S能夠增加電壓依賴(lài)性鉀通道總電流。當(dāng)洗去H2S后，KATP通道興奮性消失。以上研究表明，與NO及CO通過(guò)激活cGMP通路產(chǎn)生擴(kuò)血管活性不同，H2S舒張血管平滑肌的功能是通過(guò)開(kāi)放血管平滑肌細(xì)胞的KATP通道來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

2008年，Yang等[3]標(biāo)記小鼠的CSE基因，以野生型小鼠（基因型CSE＋／＋）為對(duì)照組，選擇突變的純合子鼠（基因型 CSE－／－）和雜合子鼠（基因型 CSE－／＋）作為研究對(duì)象。與野生型鼠相比，用苯腎上腺素收縮腸系膜動(dòng)脈條后，乙酰甲膽堿對(duì)突變型鼠腸系膜動(dòng)脈的舒張作用顯著下降。對(duì)于剝除內(nèi)皮的野生型小鼠和突變小鼠，乙酰甲膽堿的血管舒張活性均基本消失。因此確證，H2S擴(kuò)血管作用機(jī)制還依賴(lài)于內(nèi)皮衍生化松弛因子（Endothelium Derived Relaxing Factor，EDFR）[3]。乙酰甲膽堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的刺激會(huì)導(dǎo)致1，4，5-三磷酸肌醇的大量生成，進(jìn)而與肌漿網(wǎng)上的1，4，5-三磷酸肌醇受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放通道，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。受到Ca2+激活的鈣調(diào)蛋白，通過(guò)形成活化的Ca2+-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物，再與CSE結(jié)合從而增加酶活力，催化內(nèi)源性H2S的生成。

Mustafa等[17]的進(jìn)一步研究表明，H2S對(duì)內(nèi)皮松弛作用也可歸因于超極化作用，即內(nèi)皮衍生超極化因 子（endothelium-derived hyperpolarizing factor，EDHF）的效果。生物體內(nèi)源性H2S分子正是通過(guò)激活血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞中ATP敏感的中電導(dǎo)以及小電導(dǎo)鉀通道來(lái)產(chǎn)生超極化和擴(kuò)血管效應(yīng)（見(jiàn)圖3）。這也闡明了H2S開(kāi)放KATP通道的作用機(jī)制。

圖3 H2S的血管擴(kuò)張活性機(jī)制[16]

3.2 抑制血管平滑肌的增殖

Du等[18]發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2S可以通過(guò)下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase，MAPKs）的活性，進(jìn)而劑量依賴(lài)地抑制大鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖。其后，Yang等[19]探究了CSEH2S系統(tǒng)對(duì)CSE過(guò)度表達(dá)的HEK-293細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示，CSE的過(guò)度表達(dá)會(huì)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并增強(qiáng)上游p21Cip/WAK-1基因的表達(dá)，從而抑制平滑肌細(xì)胞增殖。此外，近年來(lái)研究表明，內(nèi)源性CSE-H2S通路參與體內(nèi)多種心血管疾病（自發(fā)性高血壓[20]、N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導(dǎo)的高血壓[21]、低氧肺動(dòng)脈高壓[22]以及敗血性和內(nèi)毒素休克[23]）的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸。因此，研究和開(kāi)發(fā)能改善CSE生理活性或者調(diào)節(jié)H2S所介導(dǎo)通路的藥物，對(duì)心血管疾?。ㄓ绕涫歉哐獕海┑闹委熅哂袠O其重要的借鑒意義。

3.3 神經(jīng)調(diào)節(jié)作用

生理濃度下的H2S可以激活腺苷酸環(huán)化酶（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和蛋白激酶 A（proteinkinase A，PKA）的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而增強(qiáng)N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDA）介導(dǎo)的反應(yīng)，并誘導(dǎo)海馬體的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）[24]。此外，研究者們發(fā)現(xiàn)，H2S通過(guò)L型/T型鈣離子通道和細(xì)胞膜上的NMDA受體作用來(lái)增加神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及小神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡[25]。最后，在原代培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中，研究者們發(fā)現(xiàn)H2S可以通過(guò)調(diào)控Cl-/HCO3-交換和Na+/H+交換來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH水平[26]。因此，H2S通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡和細(xì)胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)，從而介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)，發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。

3.4 抗炎作用

白細(xì)胞粘附作用是炎癥反應(yīng)的第一步，與免疫反應(yīng)、血管損傷、動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成等過(guò)程有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，H2S供體不僅可以劑量依賴(lài)性地抑制由阿司匹林引起的白細(xì)胞粘附，而且也可以抑制阿司匹林引起的的白細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞上粘附因子表達(dá)[27]。此外，還發(fā)現(xiàn)H2S供體對(duì)炎癥部位的白細(xì)胞浸潤(rùn)以及角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足腫模型都有明顯的抑制作用[28]。

H2S介導(dǎo)的抗炎機(jī)制對(duì)神經(jīng)細(xì)胞也具有保護(hù)作用。2007年，Hu等[29]發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及永生化小鼠的BV2膠質(zhì)細(xì)胞中，NaHS可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的NO等炎癥因子生成和釋放、減少腫瘤壞死因子α的分泌。其后，Lee等[30]也證實(shí)H2S供體型化合物在神經(jīng)炎癥中對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，例如去甲茴三硫、S-雙氯芬酸鈉、S-阿司匹林（見(jiàn)圖4）。研究發(fā)現(xiàn)，H2S可能通過(guò)抑制炎癥因子的生成并促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的生成來(lái)減輕神經(jīng)元細(xì)胞炎癥反應(yīng)。當(dāng)給予小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞適當(dāng)刺激后，這兩種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生致炎因子，從而導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。H2S可以上調(diào)如白介素-4/10等抗炎因子，并抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β以及NO等炎癥因子的產(chǎn)生，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受炎癥因子的進(jìn)攻（見(jiàn)圖 5）。

圖4 H2S供體型化合物

圖5 H2S對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞抗炎機(jī)制[30]

4 內(nèi)源性H2S分子的檢測(cè)手段

隨著化學(xué)、生物學(xué)和材料科學(xué)的交叉越來(lái)越深入，利用熒光手段研究有機(jī)小分子在生物體中的作用機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。其中用于檢測(cè)H2S釋放和定位的小分子熒光探針更是飛速發(fā)展。這些小分子熒光探針主要包括利用H2S還原反應(yīng)的疊氮類(lèi)熒光探針[31]，基于邁克爾加成反應(yīng)的熒光探針[32]，離子絡(luò)合類(lèi)熒光探針[33]以及近紅外比率型熒光探針[34]。其中，近紅外感受器具有低背景干擾以及高細(xì)胞穿透力的特點(diǎn)，使其對(duì)H2S在低穩(wěn)態(tài)濃度下的定量檢測(cè)更為準(zhǔn)確。因此，研究者們可以嘗試?yán)媒t外的熒光性質(zhì)來(lái)設(shè)計(jì)靈敏度更高、響應(yīng)時(shí)間更短的探針，從而簡(jiǎn)化對(duì)細(xì)胞內(nèi)H2S釋放的檢測(cè)。

圖6 H2S供體型化合物

5 H2S供體型藥物的發(fā)展

從天然植物中提取含硫化合物曾受到研究者廣泛關(guān)注。例如大蒜提取物中的二烯丙基多硫化物可在紅細(xì)胞中通過(guò)硫醇依賴(lài)性的方式生成硫化氫,這也是大蒜實(shí)現(xiàn)降血壓、保護(hù)心血管的主要機(jī)制。

隨著H2S在生物體內(nèi)釋放指征的明確，研究者們可以設(shè)計(jì)更多H2S釋放的供體靶向藥物。目前，在現(xiàn)有藥物基礎(chǔ)上進(jìn)行基團(tuán)改造使之釋放H2S，也是當(dāng)代藥物研發(fā)的一個(gè)分支。例如，因?yàn)镠2S供體可以抑制磷酸酯酶，參與勃起功能障礙的調(diào)節(jié)，專(zhuān)門(mén)研發(fā)硫化氫供體類(lèi)型藥物的CTG-Pharma公司將H2S供體的化合物與西地那非拼合，合成了西地那非-茴三硫，用于松弛陰莖海綿體平滑肌，其對(duì)磷酸酯酶的抑制強(qiáng)于西地那非[35]（見(jiàn)圖6-1）。

為了減弱非甾體抗炎藥（Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs）對(duì)胃腸道、肝、腎以及血液系統(tǒng)等不良反應(yīng)，研究者常常將H2S供體基團(tuán)和NSAIDs拼合，從而形成新的化學(xué)實(shí)體。如Antibe Therapeutics公司將H2S供體（4-羥基硫代苯甲酰胺）和萘普生拼合得到ATB-346（見(jiàn)圖6-2），以期待用于改善骨關(guān)節(jié)炎的治療。與萘普生相比，ATB-346不僅可以更有效地抑制COX-2的活性，還可以減少對(duì)胃腸道的損傷，加速已有胃潰瘍病灶的愈合[36]，目前ATB-346已處于臨床前有效性和毒理測(cè)試階段。拼合去甲茴三硫的雙氯芬酸鈉衍生物ATB-337（見(jiàn)圖6-4），不僅白細(xì)胞粘附作用下降，抗炎活性增強(qiáng)，而且胃腸道副作用減小，降低藥物副作用[11]。此外，Antibe Therapeutics公司將美沙拉嗪和去甲茴三硫拼合的化合物ATB-429，針對(duì)伴隨炎癥性腸胃病的內(nèi)臟痛，其鎮(zhèn)痛效果顯著[37]（見(jiàn)圖6-3）。

值得一提的是，Kodela等[38]將NO供體和H2S供體同時(shí)和阿司匹林拼合，形成NO和H2S雙供體型阿司匹林化合物NOSH-1（見(jiàn)圖6-5）。在角叉菜膠大鼠足腫脹模型中，NOSH-1抗炎活性和阿司匹林相當(dāng)。而在抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)中，NOSH-1對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50為48±3 nm，其抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于阿司匹林。NOSH-1以4倍IC50濃度孵育細(xì)胞24小時(shí)，其乳酸脫氫酶釋放小于10%，證明了NOSH-1是選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的活性化合物。對(duì)大腸癌異種移植的大鼠連續(xù)給藥6天后，其腫瘤體積明顯縮小。Chattopadhyay等[39]確證NOSH-1能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞G0/G1周期停滯來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，這也為硫化氫供體型化合物的研發(fā)拓展了新的領(lǐng)域。

6 展 望

綜上所述，H2S對(duì)人體各個(gè)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用不可小覷。作為一種新型的氣體信號(hào)分子，其在擴(kuò)張血管平滑肌、抑制平滑肌增殖、神經(jīng)保護(hù)以及抗炎中均發(fā)揮了重要的作用。在此基礎(chǔ)上，拼合硫化氫供體型藥物的問(wèn)世也引起當(dāng)代新藥研發(fā)的關(guān)注。然而，由于對(duì)H2S釋放指征的缺乏，H2S從生理組織產(chǎn)生到作用部位的釋放過(guò)程還有待闡明，其在病理?xiàng)l件下的生物學(xué)功能以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也有待進(jìn)一步的探究。隨著越來(lái)越多檢測(cè)手段的發(fā)展，研究者們對(duì)H2S在人體生理系統(tǒng)內(nèi)的調(diào)控將越來(lái)越明確，這必將進(jìn)一步促進(jìn)H2S及其供體型藥物在臨床的應(yīng)用。

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