白尚星

不同培養(yǎng)基對人臍帶間充質干細胞生物學特性的影響

白尚星

目的 觀察不同培養(yǎng)基對人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)生物學特性的影響, 優(yōu)化培養(yǎng)方法。方法 采用貼壁法從正常足月胎兒臍帶中分離出間充質干細胞, 細胞貼壁后利用DMEM/F12, Mesen PRORSTMMedium這兩種培養(yǎng)體系進行體外擴增, 繪制生長曲線, 流式細胞儀檢測其表面標志。結果 從人臍帶中分離出的間充質干細胞為梭形, 呈平行排列生長或漩渦狀生長；細胞表達CD29、CD44, 不表達CD34、CD45和HLA-DR。結論 加入Mesen PRORSTMMedium培養(yǎng)的細胞增殖速度快,更適合于臍帶間充質干細胞的體外擴增。

間充質干細胞；臍帶；生物學特性

間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)來源于發(fā)育早期的中胚層, 是具有高度自我更新能力, 高度增殖能力和多向分化潛能的多能干細胞［1,2］, 廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中［3］。臍帶為分娩廢棄物, MSC含量豐富, 無需有創(chuàng)穿刺即可獲得, 且較骨髓來源的MSC擴增能力更強, 成為近年來MSC研究的重要來源之一［4］。本研究采用兩種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)hUC-MSCs, 并對其進行生物學特性的觀察、細胞免疫表型的鑒定, 以期建立一種穩(wěn)定、高效、快速、經濟的hUC-MSCs富集方法, 為臨床細胞移植提供實驗支持。

1 材料

1.1 臍帶 選擇足月胎兒的臍帶, 產婦身體健康, 肝功能正常, 無傳染性疾病, 簽署知情同意書。臍帶4℃無菌保存, 4 h內完成實驗操作。

1.2 主要試劑 DMEM/F12, Mesen PRORSTMMedium和胰蛋白酶購自GibCO；胎牛血清(FBS)購自HyClone；鼠抗人抗體CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、HLADR-FITC購自BD。

2 方法

2.1 人臍帶MSCs 的分離、培養(yǎng)及擴增 臍帶剪成3～5 cm小段取出臍帶放入培養(yǎng)皿中, 用0.9%氯化鈉注射液沖洗, 洗盡血液。用手術剪剔除血管和外膜, 剪成2～3 mm小塊, 用0.9%氯化鈉注射液清洗一次, 用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗一次,分成兩組：A組加入培養(yǎng)基(含50%Mesen PRORSTMMedium, 48% DMEM/F12和2%胎牛血清), B組加入培養(yǎng)基(DMEM/F12含 10%胎牛血清)放入250 ml培養(yǎng)瓶中, 組織塊密度要適中,每瓶20 ml, 放置于37℃, 體積分數(shù)5%CO2, 飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察, 有少量成纖維狀細胞貼壁生長,倒掉培養(yǎng)基和組織塊。添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng), 每3天換液,細胞生長達80%以上時, 用胰酶消化, 按1：3傳代。

2.2 細胞生長曲線制作 取生長良好的3代細胞, 按2×104/ml濃度接種24孔板, 每孔1 ml, 3 d換液一次, 以第2 d起每隔24小時計數(shù)3個孔細胞數(shù), 取其平均值, 繪制7 d的生長曲線。

2.3 hUC-MSCs表面標記的檢測 取3代細胞, 用0.25%胰酶消化, 用PBS洗滌2次, 制成l×106的細胞懸液, 每管加入100 μl, 設置陰性對照, 加入IgG1-FITC, 其它管加入20 μl鼠抗人HLA-DR-FITC、CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC, 室溫避光孵育30 min, 流式細胞儀計數(shù)5000～10000個細胞。

3 結果

3.1 hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)和純化 兩組培養(yǎng)基原代臍帶間充質干細胞接種6～7 d, 除去組織塊, 倒置顯微鏡下可見有少量纖維狀的貼壁細胞, 2 d后形成散在的細胞集落, 大部分是長梭形的成纖維樣細胞, 細胞折光性好, 14～18 d細胞集落增多, 細胞融合80%以上。(見圖lA-B)用0.25%胰酶消化傳代, 3代后可得到較為純化的間充質干細胞, 傳代后的細胞增殖速度快, 約3～4 d可傳代1次。傳代后細胞形態(tài)較原代均一, 以平行排列生長或漩渦狀生長。兩組培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質細胞形態(tài)相似, 無明顯差別。A組貼壁細胞較多,細胞生長較快。

3.2 hUC-MSCs生長曲線 傳代后的細胞第1～2天處于滯留期, 無明顯增殖。第3～5天進入對數(shù)生長期, 細胞增殖加速達到高峰, 第6～7天進入平臺期, A組細胞增殖快于B組細胞(見圖2)。

3.3 hUC-MSCs的表面標志 流式細胞儀檢測結果表明, hUC-MSCs不表達造血細胞表面抗原標志CD34、CD45, 強表達CD29和CD44, 不表達HLA-DR, 表明本實驗分離的細胞符合間充質干細胞的表面標志；兩組培養(yǎng)基抗原表達無顯著差異。見表1。

組別CD29CD44CD45CD34HLA-DR A組0.980.940.040.150.31 B組0.950.930.030.180.29

4 討論

間充質干細胞廣泛存在于骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織中, 其中尤以臍帶間充質干細胞更為原始, 分化能力和增殖能力強, 且其來源于胚胎組織, 免疫原性更低［5］。臍帶中有2條動脈和1條靜脈, 包繞動靜脈的黏蛋白樣結締組織即為華通氏膠(Warthon’s jelly)。目前可從臍帶靜脈內皮、內皮下層、Warthon’s jelly、血管周圍組織以及羊膜來源的上皮組織等中分離得到MSCs［6］。臍帶來源廣泛, 采集方便,免疫排斥小, 倫理爭議小等優(yōu)點, 使其成為干細胞研究熱點,在細胞治療中前景越來越廣闊。本實驗成功從人臍帶中分離出間充質干細胞, 獲得的原代細胞能夠連續(xù)傳代, 傳代后細胞純度提高, 形態(tài)較原代均一, 以平行排列生長為主, 或呈漩渦狀生長, 細胞能夠大量增殖, 經流式細胞儀檢測, hUCMSCs不表達造血細胞標志CD34、CD45, 強表達CD29和CD44, 不表達HLA-DR說明其免疫原性極低, 符合間充質干細胞的特點。用于臍帶間充質干細胞體外培養(yǎng)的體系包括低糖DMEM、DMEM/F12和無血清培養(yǎng)體系。其中DMEM/F12是由DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基按1：1混合組成的, 其營養(yǎng)成分豐富, 可以使用較少血清, 或作為無血清培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基, 適于原代細胞培養(yǎng)［7,8］。Mesen PRORSTMMedium是一種無血清培養(yǎng)基, 適合于間充質干細胞的培養(yǎng), 但其價格昂貴, 不利于大量使用。本實驗在DMEM/F12培養(yǎng)基基礎上加入適量的Mesen PRORSTMMedium培養(yǎng)細胞, 結果表明, 能夠大量增殖細胞并且縮短培養(yǎng)時間, 還可以減少血清的用量, 減少移植輸注給患者時產生的不良反應。因此, 無論從培養(yǎng)角度, 還是從臨床應用考慮, 培養(yǎng)細胞時適量加入Mesen PRORSTMMedium都是較好的培養(yǎng)方式。

［1］ Caimi PF, Reese J, Lee Z, et al.Emerging therapeutic approaches for multipotent mesenehymal stromal cells.Curr Opin Hematol,2010, 17(6):505-513.

［2］ Sun NZ, Ji H.In vitro diferentiation of osteocytes and adipocytes from human placenta-derived cels.J Int Med Res, 2012, 40(2):761-767.

［3］ Pendleton C, Li Q, Chesler DA, et al.Mesenchymal stem cell derived from adipose tissue vs bone marrow:in vitro comparison of their tropism towards gliomas.PLoS One, 2013, 8(3):58198.

［4］ Bongso A, Fong CY.The therapeutic potential, challenges and future clinical directions of stem cells from the Wharton’s jelly of the human umbilical cord.Stem Cell Rev, 2013, 9(2):226-240.

［5］ Baksh D, Yao R.Tuan RS.Comparison of proliferative and multilineage diferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived fro umbilical cord and bone marrow.Stem Cells.2007, 25(6):1384-1392.

［6］ Wang HS, Hung SC, Peng ST, et al.Mesenchymal stem cells in the Wharton’s jelly of the human umbilical cord.Stem Cells, 2004, 22(12):1330-1337.

［7］ 洪敬欣, 張茜真, 韓俊領, 等.人臍帶間充質干細胞在3 種不同培養(yǎng)體系中的生長狀況及腺病毒感染效定.中國組織工程研究與臨床康復, 2010, 14(1):42-47.

［8］ 辛毅, 李娜, 黃益民, 等.人臍帶間充質干細胞的原代培養(yǎng)及多向分化潛能的研究.細胞與分子免疫學雜志, 2013, 29(10): 1087-1093.

Influence of different mediums on biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cell

BAI Shang-xing. Shenyang Sixth People's Hospital, Shenyang 110000, China

Objective To investigate the differences of biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) in different mediums, and to optimize the purify methods.Methods Mesenchymal stem cells were separated from healthy full-termed delivery fetus using tissue-adherent culture method.These cells were cultured and amplified in DMEM/F12 and Mesen PRORSTMMedium in vitro.The growth curve was drawn.Their surface markers were detected by flow cytometry.Results Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord were spindle-shaped adherent cells.They have strong proliferation ability.The results of growth curve showed that compared with two medium, hUC-MSCs in Mesen PRORSTM Medium grew quickly at every time point.They were strongly positive expression for CD44 and CD29, but negative expression for CD34, CD45 and HLA-DR.Conclusion Cell doubling time in the Mesen PRORSTMMedium was shorter than in DMEM/F12.

Mesenchymal stem cell; Umbilical cord; Biological charateristics

2014-03-10］

110000 沈陽市第六人民醫(yī)院