白靜麗

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院, 吉林 長春 130021)

肝纖維化是肝臟對各種致病因素引起肝臟損傷的一種修復反應，其實質在于細胞外基質(ECM)的異常增多和過量沉積。目前認為〔1〕，肝星狀細胞(HSC)的激活，是肝臟膠原產生和肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。研究表明，HSC的活化與多種因素有關，其中，血小板衍生生長因子(PDGF)起了重要的促進作用，α-SMA被認為是HSC活化的標志?；鐾ńj解毒顆粒是根據中醫(yī)傳統(tǒng)理論和多年臨床探索研制而成的復方中藥制劑，前期研究證明化瘀通絡解毒顆粒對四氯化碳(CCl4)誘導的大鼠肝纖維化有顯著的治療作用〔2,3〕?，F(xiàn)在前期研究的基礎上觀察該制劑對肝纖維化大鼠肝組織PDGF(PDGFB)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達的影響，以進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 正常雄性SD大鼠60只，體重200～220 g，購自吉林大學實驗動物中心。

1.2藥品及主要試劑 化瘀通絡解毒顆粒由丹參、三七、地龍、虎杖、大黃、鱉甲、黃芪、當歸等組成。參照國家藥典(1990年版)中藥制劑顆粒劑制作方法，由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室制備；氧化苦參堿為寧夏延池制藥廠產品，(淡黃色結晶粉末，純度>99%)用蒸餾水溶解為0.3 g/ml的溶液，冷藏備用。CCl4分析純：購自天津市化學試劑廠。石蠟油購自汕頭市光華化學廠(分析純)。兔抗大鼠PDGFB單克隆抗體、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司。DAB試劑盒，購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3動物模型的建立 受試大鼠隨機分為正常對照組、模型組、氧化苦參堿組、化瘀通絡解毒顆粒組各15只。

動物正常喂養(yǎng)1 w后，應用40%CCl4豆油溶液，皮下注射給藥，首次按0.5 ml/100 g體重，以后按0.3 ml/100 g體重，注射2次/w，連續(xù)8 w〔4〕。

1.4動物分組 正常對照組：從實驗第1天開始，灌胃生理鹽水1.5 ml/100 g體重，1次/d。模型組：造模同時，每天灌服等量生理鹽水。陽性對照組：造模同時，開始灌服溶氧化苦參堿液1.5 ml/100 g體重，1次/d；治療組：造模同時開始每天以1.5 ml/100 g體重灌服化瘀通絡解毒顆粒溶液，直至實驗結束。

1.5標本的采集 各組于8 w末，于肝左葉同一部位取肝組織迅速投入液氮，之后轉入-70℃冰箱保存，備肝組織勻漿測組織生化。一部分置入10%中性甲醛中固定，3 d內石蠟包埋，備病理檢測和免疫組化。

1.6免疫組化染色 采用S-P 法檢測，用PBS代替一抗作陰性對照，應用HPIAS2000 型圖像分析軟件進行定量分析。結果判定參照文獻〔5〕略修改：陽性染色結果顯示為細胞質的棕黃色顆粒，細胞核復染為藍色。每張切片不同部位隨機觀察5個高倍鏡視野分別記錄顯色程度和顯色范圍，顯色程度分弱、中、強，分別用+，，記錄；顯色范圍占高倍視野<1/4時記錄+，占高倍視野1/4～2/4時記錄，占高倍視野2/4～3/4時記錄，占高倍視野﹥3/4時記錄。然后按以下公式計算顯色指數(shù)。顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍(+、、、分別按1、2、3、4分計算)取均數(shù)為每一種蛋白表達的最終顯色指數(shù)。

2 結 果

2.1PDGFB在肝組織中的表達 PDGFB陽性表達細胞胞質呈棕黃色。正常對照組僅在門靜脈血管內呈輕微表達，模型組陽性表達明顯增強，陽性細胞數(shù)目增多，著色較深，主要分布于匯管區(qū)、門脈血管壁、炎細胞和竇周細胞,變性的肝細胞也有表達。各給藥組PDGFB陽性表達減少，主要見于肝竇旁及匯管區(qū)。免疫組化定量分析結果表明，模型組PDGFB表達量明顯高于正常組(P<0.01)，治療組表達量明顯下降(P<0.01)，表明化瘀通絡解毒顆粒能明顯減少大鼠肝臟PDGFB的表達，PDGFB在各實驗組中表達及相對含量，見表1。

2.2α-SMA在肝組織中的表達 α-SMA表達陽性細胞胞質呈棕黃色。正常對照組僅在血管壁少量陽性表達，肝血竇內未見陽性反應細胞。模型組肝小葉中央靜脈附近出現(xiàn)少量的棕黃色陽性反應細胞，主要分布于肝索間的肝血竇內，部分陽性細胞突起延長。與模型組比較，各給藥組上述部位陽性細胞數(shù)目顯著減少，胞質陽性染色顯著減輕，α-SMA表達明顯降低(P<0.01)，且治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝組織中PDGF-B、α-SMA蛋白表達水平變化±s)

3 討 論

PDGF是最強烈的有絲分裂原，對HSC的活化、分裂、增殖及其合成膠原等均有明顯的促進作用。PDGF有3種形式：PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB。PDGF-AB、PDGF-BB都能促進HSC增殖，但PDGF-BB作用最強。肝細胞受損后，發(fā)生變性、壞死和炎癥細胞浸潤，激活肝臟的枯否細胞，釋放大量的細胞因子，再次激活肝貯脂細胞，使之增生、活化，轉化為肌纖維樣細胞，表達α-SMA并釋放一些細胞因子，使細胞外基質合成增加，降解減少，最終導致肝纖維化形成。

HSC在活化過程中表達α-SMA，所以α-SMA是HSC是否激活的重要標志物。本實驗結果說明化瘀通絡解毒顆粒和氧化苦參堿可抑制肝纖維化大鼠肝HSC活化或增殖。化瘀通絡解毒顆粒組PDGF-B、α-SMA表達略低于氧化苦參堿組，但不明顯。

綜上，化瘀通絡解毒顆粒具有減輕纖維化程度，抑制PDGF-B、α-SMA的表達。其中抑制PDGF-B、α-SMA的表達，進而抑制HSC的活化可能是其抗肝纖維化的作用機制之一。

4 參考文獻

1李 才.器官纖維化基礎與臨床〔M〕．北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：2-3.

2白靜麗,劉慶彬.化瘀通絡解毒顆粒對肝纖維化大鼠TGF-β1、Smad3表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(10):2946-9.

3江海燕, 王春妍,楊世忠.化瘀通絡解毒顆粒對肝纖維化大鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛和轉化生長因子TGF-β1的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2007;13(6):59-60.

4孫敬方．動物實驗方法學〔M〕．北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：474-5．

5Gressner AM, Weiskirchen R,Breitkopf K,etal.Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis 〔J〕.Front Biosci,2002;7(3):793.