陳文龍 曹文富 何 英 高世嬌

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結合科，重慶 400016)

肝纖維化是肝組織對慢性、反復性損傷的修復反應，是多種類型細胞、氧化應激、細胞因子和生長因子等共同參與的一系列復雜作用的結果，以細胞外基質(ECM)成分的過度增生與異常沉積為主要特征〔1〕。無論何種原因引起的慢性肝臟損傷都涉及肝纖維化過程〔2〕。目前單純西醫(yī)治療肝纖維化手段有限。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法中藥煎劑可以降低肝組織內纖維化程度，且以益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四法合用作用最強〔3〕。近年來，有越來越多的研究表明，肝纖維化發(fā)生機制與過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)密切相關〔4〕。因此，本研究擬在既往研究的基礎上，進一步觀察不同劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰方藥對肝纖維化大鼠肝組織結構及PPARγ表達的影響。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 本試驗所需中藥飲片均購自于重慶桐君閣大藥房，秋水仙堿由云南植物藥業(yè)公司生產(chǎn)；PPARγ一抗、二抗及Western印跡試劑盒均購自于北京中杉公司，Trizol總RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒、擴增試劑均由Takara公司生產(chǎn)，普通PCR儀、凝膠成像儀為BIO-RAD公司，紫外公光光度儀為Beckman公司，H-7500型電鏡為日本日立公司生產(chǎn)。

1.2肝纖維化造模方法 參考文獻〔5〕方法，大鼠皮下注射CCl4溶液，首劑量為5.0 ml/kg體重，以后每隔3 d皮下注射40%CCl4橄欖油溶液(劑量0.3 ml/100 g)，持續(xù)4 w。造模開始2 w給予高脂、低蛋白質復合飼料(豬油20%+膽固醇0.5%+玉米粉79.5%)，2 w后改用普通飼料，6 w造模期間用10%白酒作為唯一飲料。

1.3動物分組 雄性SD大鼠110只，體重180～220 g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心〔許可證號：SYXK(渝)2007-0001〕，于重慶醫(yī)科大學SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，動物自由進食進水。實驗室采用12 h自動光暗交替，相對濕度55%，溫度(23±2)℃。動物在適應性喂養(yǎng)1 w后進行實驗。將大鼠隨機分為正常組、肝纖維化模型組、秋水仙堿組、益氣化瘀化痰養(yǎng)陰低劑量組、中劑量組及高劑量組。除正常組外，其余各組均制備肝纖維化模型，造模結束后隨機取2只大鼠行HE染色進行驗證。

1.4動物處理 (1)正常組及肝纖維化模型組灌服生理鹽水(3 ml/100 g，1次/d)；(2)秋水仙堿組給予秋水仙堿水溶液灌胃(0.01 mg/100 g，1次/d)；(3)益氣化瘀化痰養(yǎng)陰低、中、高劑量組分別給予1、2、4 g/ml煎劑(3 ml/100 g，1次/d)。12 w后處死大鼠。

1.5中藥制備 精選黃芪、白術、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍、鱉甲(藥物比例2∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶2)，混合水提并濃縮成益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥煎劑，低、中、高劑量中藥煎劑每毫升分別含生藥1、2、4 g。

1.6標本采集與處理 最后一次用藥后24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，于冰盒上處死大鼠，摘取肝臟，取部分肝組織分別用10%甲醛和4%戊二醛固定，待做HE染色及電鏡檢查，其余標本于液氮中冷凍后再轉移到-70℃冰箱中保存。

1.7觀察指標

1.7.1光鏡觀察 肝組織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片、HE染色及Masson染色，光鏡觀察肝組織病理結構，采用METAVIR評分系統(tǒng)〔6〕把肝纖維化分為4級。

1.7.2電鏡觀察 活體大鼠麻醉后取下1 mm3肝組織，立即放入4℃ 4%戊二醛溶液中固定2 h，0.1 mmol/L PBS液清洗3次，4℃ 1%四氧化鋨溶液中固定2 h，常規(guī)乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋、聚合，制備0.5 μm厚度半薄切片，在光鏡下定位后再制備60 nm厚度超薄切片，再經(jīng)醋酸鈾、枸椽酸鉛染色，H-7500型電鏡觀察。

1.7.3RT-PCR法檢測肝組織PPARγ mRNA表達 根據(jù)試劑說明書，提取大鼠肝組織總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA濃度和純度，42℃ 20 min條件下逆轉錄為cDNA。PPARγ正義：5′-CCTTTACCACGGTTGATTTCTC-3′，反義：5′-TTCAATCGGATGGTTCTTCG-3′，目的片段為319 bp，退火溫度53.8℃。內參GAPDH正義：5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′，反義：5′-GTGGAAGAATGGGAGTTGCTGT-3′，產(chǎn)物長度610 bp，退火溫度58.5℃。PCR反應條件預變性94℃ 3 min；94℃ 30 s，53.8℃(內參為58.5℃)30 s，72℃ 45 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應結束后取PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，并將凝膠置于凝膠成像儀上用Quantityone 4.6圖像分析軟件進行照相分析。各條帶的相對光密度值=目的條帶光密度值/內參GAPDH條帶光密度值。

1.7.4Western印跡法檢測肝組織PPARγ蛋白表達 稱取一定量的肝臟組織，加入10倍體積的組織裂解液勻漿，冰浴30 min后，4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清，BCA試劑盒蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。30 g蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜(Millipore)，3%BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBS-Tween洗膜后加HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，經(jīng)EC檢測系統(tǒng)檢測各組PPARγ蛋白表達。

2 結 果

2.1各組大鼠一般情況 實驗過程中，大鼠死亡率約為26.3%，僅正常組大鼠無死亡，各組大鼠存活率無明顯差異。正常組大鼠體重明顯增加，體格健壯，反應靈敏，毛發(fā)有光澤；模型組大鼠瘦弱，反應遲鈍，毛發(fā)干枯無光澤，部分毛發(fā)打結，食欲差，腹部略顯飽滿，其余各治療組均較模型組有不同程度好轉。

2.2不同劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法中藥對肝組織病理形態(tài)的影響

2.2.1光鏡觀察 (1)HE染色及Masson染色：正常組大鼠肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞呈多邊形，無變性、壞死，有1～2個圓形細胞核，核仁明顯，核內染色質稀疏，染色較淺，胞質豐富；模型組可見肝纖維化間隔伴小葉結構紊亂，肝細胞內大量大小不等空泡，細胞核被擠壓到細胞邊緣，并可見大量炎性細胞浸潤，且以匯管區(qū)最明顯；秋水仙堿組肝細胞內空泡較模型組明顯減少；益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥中、高劑量組肝組織形態(tài)基本正常，僅于匯管區(qū)有少量炎性細胞浸潤，而益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥低劑量組與模型組形態(tài)較接近。見圖1。(2)肝纖維化程度：各組之間纖維化程度差異具有統(tǒng)計學意義(F=39.539,P=0.00)。肝纖維化程度順序為：模型組>中藥低劑量組>秋水仙堿組>中藥中劑量組>中藥高劑量>正常組。其中，中藥低劑量與模型組差別無統(tǒng)計學意義(P=0.162)，與中藥中、高劑量組相比具有顯著差異(P=0.00)，中藥中劑量與高劑量差別無統(tǒng)計學意義(P=0.688)。見表1。

Ⅰ:正常組；Ⅱ:模型組；Ⅲ:秋水仙堿組；Ⅳ:中藥低劑量組；Ⅴ:中藥中劑量組；Ⅵ:中藥高劑量組；下圖同

表1各組大鼠肝纖維化METAVIR評分比較(n)

組別nMETAVIR評分0級 1級 2級 3級 4級平均Ridit值正常組101000000.175模型組11001820.8561)秋水仙堿組15156300.5941)2)中藥低劑量組13014710.7681)中藥中劑量組15852000.3321)2)中藥高劑量組16961000.3101)2)合計802817141830.5001)2)

2.2.2電鏡觀察 正常組肝細胞形態(tài)正常，細胞間緊密連接，內質網(wǎng)、線粒體及核蛋白體豐富，毛細膽管微絨毛豐富，形態(tài)正常；模型組及中藥低劑量組可見肝纖細內大量脂滴，細胞核基本正常，線粒體、內質網(wǎng)等細胞器腫脹且數(shù)量明顯減少，糖原稀疏，并可見較多成纖維細胞及少量淋巴細胞浸潤，周圍可見大量纖維沉積；秋水仙堿組、中藥中劑量及高劑量組形態(tài)與正常組形態(tài)相似。見圖2。

(×15 000) (×10 000) (×10 000)

(×12 000) (×10 000) (×15 000)

2.3不同劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法中藥對肝組織PPARγ的影響

2.3.1肝組織PPARγ mRNA表達 模型組〔(42.46±8.00)%〕及中藥低劑量組〔(42.45±7.09)%〕肝組織PPARγ mRNA含量低于正常組〔(59.03±9.64)%〕，而中藥中、高劑量組〔(65.86±5.97)%、(66.54±7.33)%〕高于正常組。對肝組織PPARγ mRNA相對濃度進行方差分析(F=30.75,P<0.01)，顯示模型組、各治療組肝組織PPARγ mRNA與正常組比較差異顯著(P<0.05)，且以模型組和中藥低劑量組降低最明顯(P=0.00)；與模型組相比，中藥低劑量組〔(51.88±5.66)%〕PPARγ mRNA無明顯升高(P=0.99)，而秋水仙堿〔(51.88±5.66)%〕以及中藥中、高劑量組明顯升高，以中藥中、高劑量升高最明顯(P=0.00)，中藥中劑量與高劑量組之間無明顯差異(P=0.792)。見圖3A。

2.3.2不同劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥對肝組織PPARγ蛋白表達的影響 各組大鼠肝組織PPARγ蛋白表達情況與肝組織內PPARγ mRNA水平基本一致(F=21.34,P<0.01)。肝纖維化模型組中PPARγ蛋白表達最少(0.28±0.09)，其次為中藥低劑量組(0.31±0.06)，且這兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.50)；中藥中劑量與高劑量組肝組織PPARγ蛋白含量(0.53±0.10、0.54±0.10)接近正常組(P=0.59，0.73)，中藥中劑量及高劑量組也無明顯差異(P=0.84)。正常組及秋水仙堿組分別為0.55±0.10，0.43±0.090，見圖3B。

圖3 肝組織PPARγ mRNA、蛋白含量

3 討 論

肝纖維化的形成是一個復雜的動態(tài)過程，是諸多慢性肝病向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)，早期有效地控制并逆轉肝纖維化進程對阻止肝硬化具有重要意義。然而，目前尚無切實有效的肝纖維化治療方案〔7〕。

近年來，PPARγ及其配體在肝纖維化中的作用越來越受到重視。許多研究表明，PPARγ及其配體參與了肝星狀細胞(HSC)向肌成纖維細胞(MFB)轉變的TGF-β信號通路、肝生長因子(HGF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血小板源性生長因子(PDGF)信號通路及瘦素、脂聯(lián)素等細胞內信號轉導等多信號通路〔4，8〕。在這些通路中，PPARγ的表達、活化與HSC的活化、增殖，ECM沉積、降解以及肝纖維化的發(fā)展密切相關。

我們在研究中發(fā)現(xiàn)，中、高劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰中藥可提高肝纖維化模型大鼠肝組織內PPARγ mRNA水平，PPARγ蛋白較正常組有增高趨勢，但組間比較無統(tǒng)計學意義，兩者變化不一致。出現(xiàn)上述表現(xiàn)的原因，我們推測一方面可能是外源性配體競爭性抑制內源性配體，使PPARγ蛋白結構發(fā)生改變〔9〕，導致PPARγ蛋白表達相對減少；另一方面可能是肝纖維化時，脂質過氧化和以TNF-α為主的炎性介質釋放皆可激活ERK信號通路，由ERK通路介導的磷酸化反應能通過對PPARγ的磷酸化降低PPARγ轉錄活性〔10〕。但具體原因有待進一步研究。

雖然傳統(tǒng)中醫(yī)并無“肝纖維化”這一概念，但歷代醫(yī)家對其證候、病因病機、防治措施等早有論述，主要散在于“黃疸”、“脅痛”、“積聚”、“鼓脹”等疾病。2006年，中國中西醫(yī)結合學會肝病專業(yè)委員會制定了《肝纖維化中西醫(yī)結合診療指南》，將肝纖維化證候歸納為氣陰虛損和瘀血組絡2個基本證型以及肝膽濕熱、肝郁脾虛、肝腎陰虛3個常見證型〔11〕。臨床發(fā)現(xiàn)痰濁壅滯也是肝纖維化的常見證型〔12〕。我們認為肝纖維化基本病機特點為本虛標實，本虛主要是指氣虛與陰虛，標實主要是指瘀血及痰濁?！皻馓撆c陰虛并見，痰凝與瘀血互結”既然為肝纖維化的基本病機，就可按益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法立法論治。

本研究選用益氣藥(黃芪、白術)、活血化瘀藥(川芎、姜黃)、化痰藥(半夏、海藻)、養(yǎng)陰藥(白芍、鱉甲)，其中黃芪具有益氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利水消腫的功效，是臨床上最常用的益氣藥物之一；白術能益氣健脾、燥濕利水，與黃芪配伍使用，能增強益氣健脾、利濕之功；川芎能活血祛瘀、行氣開郁、祛風止痛，為“血中之氣藥”；姜黃“主心腹結積，下氣，破血，消癰腫”(出自《新修本草》)。半夏燥濕化痰，消痞散結，為化痰要藥；海藻能消痰散結軟堅，利水消腫；白芍養(yǎng)血柔肝，緩中止痛，斂陰收汗，是最常見的養(yǎng)陰柔肝藥之一；鱉甲滋陰潛陽，軟堅散結。益氣藥黃芪、白術與化痰藥半夏、海藻配伍，能協(xié)同發(fā)揮益氣健脾、化痰散結作用；與化瘀藥川芎、姜黃配伍，共同顯示益氣化瘀化痰功效；再與養(yǎng)陰藥白芍、鱉甲配伍共湊養(yǎng)氣養(yǎng)陰、柔肝散結之功效。一是通過益氣養(yǎng)陰法扶助正氣，使津氣血津液能正常運行，從而杜絕痰濁與瘀血的生成；二是以化瘀化痰法促進已成之“痰濁與瘀血”消散化除，使處于痰濁凝聚與痰瘀互結病理進程的肝組織結構及功能復原的目的。諸多國內研究已表明以上八味中藥可以有效抑制或者調節(jié)參與各種器官纖維化中的關鍵因子，如TGF-β1、TIMP-1、 MMPs等〔13～15〕。而對PPARγ等較新的、在纖維化過程中也發(fā)揮著重要作用的指標研究甚少。

本文結果顯示，中高劑量益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法中藥能增加肝組織內PPARγ mRNA和蛋白表達，對肝纖維大鼠具有治療作用，而低劑量治療效果不明顯。這可能是因為益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法中藥的治療效果呈劑量-效應關系，低劑量中藥不足以增強肝組織內PPARγ mRNA和蛋白表達。然而，本研究目前僅設立了三個劑量組，且無血藥濃度監(jiān)測，缺乏益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法中藥抗肝纖維化劑量-效應關系方面的具體數(shù)據(jù)。

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