鄧紫婷 周國慶 李榮亨 李 強 曾 麗

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)主要特征為關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡和細胞外基質(zhì)的進行性降解〔1〕。蛋白聚糖酶屬于帶有血小板反應蛋白結(jié)構(gòu)域單元的裂解素和金屬蛋白酶(ADAMTs)家族。近年研究發(fā)現(xiàn)在OA早期，ADAMTS是降解蛋白多糖的主要酶系，比基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)作用大約提前3 w左右，且抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5能有效防止關(guān)節(jié)軟骨的破壞，其降解部位主要在蛋白多糖核心蛋白球間區(qū)域(IGD)的Glu373-Ala374作用位點〔2,3〕。復元膠囊是在長期臨床實踐的基礎(chǔ)上總結(jié)出來的治療OA的中藥復方制劑，臨床觀察發(fā)現(xiàn)其對OA的療效確切，不良反應少。前期研究顯示，復元膠囊通過調(diào)節(jié)細胞因子、MMPs及其抑制劑(TIMPs)和生長因子之間的平衡〔4〕，抑制軟骨中誘導性一氧化碳合酶(iNOS)的表達,減少NO的產(chǎn)生〔5〕，減少Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解〔6〕，促進細胞增殖，減少細胞凋亡，從而發(fā)揮對OA的防治作用〔7〕。本文觀察不同濃度復元膠囊對關(guān)節(jié)軟骨中ADAMTS-4和ADAMTS-5表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 雄性8周齡SD大鼠60只，體重(200±10)g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(渝)2012-0001。復元膠囊：重慶希爾安藥業(yè)公司生產(chǎn)(批準文號：渝衛(wèi)2002〔42-33〕)，由黃芪、人參、川芎、丹參、淫羊藿、鹿角膠、肉蓯蓉、骨碎補、枸杞子等中藥組成，每粒0.41 g,每克粉末含生藥3 g；抗骨增生膠囊：江蘇康緣股份有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號：110402。ADAMTS-4和ADAMTS-5多克隆抗體，購于美國Santa Cruz公司；SABC試劑盒及DAB顯色劑購于武漢博士德生物工程有限公司；軟骨總提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及2X Es Taq MasterMix(含染料)均來自于北京康為世紀；ADAMTS-4、ADAMTS-5及內(nèi)參GAPDH引物由TakaRa公司合成(見表1)；SDS-PAGE凝膠試劑盒、RIPA蛋白提取試劑盒均由碧云天公司生產(chǎn)。BX50型光學顯微鏡來自日本OLYMPUS公司；DNA engine PT-200 PCR儀、BIO-RAD電泳儀及BIO-RAD凝膠成像儀來自美國BIORAD公司。

表1 引物序列情況

1.2方法

1.2．1分組及造模 將60只大鼠隨機分為正常組，模型組，抗骨增生膠囊組，復元膠囊低、中、高劑量組，每組10只。Hulth法〔8〕建立OA模型，用10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，在無菌條件下切斷大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板及剪斷前后交叉韌帶逐層縫合，無菌包扎。術(shù)后給予肌注青霉素抗感染，共7 d。術(shù)后1 w開始每天驅(qū)趕大鼠跑步30 min，共驅(qū)趕4 w。正常組大鼠不給予任何處理。

1.2.2給藥 依據(jù)Meeh-Rubner公式計算大鼠的等效給藥劑量，復元膠囊低、中、高劑量組分別給予復元膠囊371.65、743.30、2 229.90 mg·kg-1·d-1,抗骨增生膠囊組給予抗骨增生膠囊557 mg·kg-1·d-1, 均配置成3 ml溶液，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，于術(shù)后第2周開始，每天灌胃1次，共4 w。

1.2.3光鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨細胞及基質(zhì) 于治療后第4周處死各組大鼠共60只，觀察并記錄關(guān)節(jié)囊、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液的一般情況，取脛骨平臺全層軟骨連同軟骨下骨標本，將其中一部分放置在-80℃冰箱保存，一部分在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，10%EDTA脫鈣15 d，常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色觀察軟骨組織結(jié)構(gòu)、細胞數(shù)量和潮線的完整性。依據(jù)Mankin法〔9〕評分標準進行評分，0級為正常;1級為表層破壞;2級為血管翳及表層破壞;3級為淺層裂隙形成;4級為局限性深達骨質(zhì)的裂隙;5級為大面積深達骨質(zhì)的軟骨缺如;6級為負重區(qū)軟骨全部丟失。

1.2.4免疫組化法檢測關(guān)節(jié)軟骨中蛋白聚糖酶1、2的蛋白表達 切片脫蠟至水，3%H2O2室溫15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。沖洗后PBS浸泡5 min，胰蛋白酶消化液修復抗原活性20 min，正常山羊血清封閉，分別滴加1∶50的稀釋抗大鼠ADAMTS-4和ADAMTS-5多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，4℃孵育過夜。PBS沖洗5 min，3次。滴加生物素標記的二抗(武漢博士德)，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次。滴加SABC-HRP(武漢博士德)，37℃孵育30 min。PBS沖洗5 min，3次。DAB室溫下顯色至滿意，自來水終止反應。蘇木素復染3 min，洗去多余染液，鹽酸酒精分化2 s，碳酸鋰復染1 min，酒精梯度脫水后封片，顯微鏡下觀察。圖像分析：每個標本取5張切片，每張切片OLYMPUS BX50顯微鏡下放大200倍，隨機取5個視野，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定陽性染色平均累積光密度(IOD)。

1.2.5關(guān)節(jié)軟骨總RNA提取和半定量RT-PCR檢測ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表達 取損傷區(qū)軟骨30 mg在液氮中研磨成粉末，然后用TRIzol提取總RNA，紫外分光光度計檢測樣品吸光度(A)，A260/A280為1.8-2.0。每組取1 μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(dNTP Mix,2.5 mmol/L Each 4 U、Primer Mix 2 μl、RNA Template 2 μl、5×RT Buffer 4 μl、DTT，0.1 mol/L、HiFi-MMLV,200 U/μl,1 μl、RNase-free Water 5 μl)。取cDNA 1 μl進行PCR擴增。擴增完畢后取5 μl產(chǎn)物于含50 μl/L GoldViewTM核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用BRO-RAD凝膠圖像分析軟件檢測各組目的基因及內(nèi)參的光密度值。

1.2.6Western印跡法檢測軟骨中ADAMTS-4和ADAMT-5的蛋白表達量 于-80℃中取出軟骨組織，用RIPA試劑盒(碧云天公司)提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，按每孔50 μg上樣，在10%的SDS-PAGE凝膠上電泳后，用濕法轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至0.45 μm孔徑的PVDF膜上，用5%BSA在37℃條件下封閉2 h后，分別敷上抗ADAMTS-4、ADAMTS-5及抗β-actin的多克隆抗體(1∶50稀釋)，在4℃過夜，用TBST洗3次，每次15 min。然后分別敷上羊抗兔及抗小鼠抗體，37℃ 條件下放置1 h后，用TBST沖洗3次，每次15 min。在暗室中敷上BeyoECL發(fā)光液，用ChemiDoc XRS凝膠/發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行顯影，并采用Quantitiy One軟件計算條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1HE染色后觀察軟骨組織 正常組軟骨組織4層結(jié)構(gòu)清晰，軟骨表層光滑平整，細胞排列整齊，基質(zhì)染色均勻,潮線清晰Mankin評分為(0.33±0.08)分；模型組軟骨組織層變薄，表層裂隙交錯分布，細胞數(shù)目變少，排列紊亂，潮線嚴重斷裂模糊Mankin評分為(6.9±0.30)分；抗骨增生膠囊組軟骨表面欠光整，細胞層數(shù)增多，排列稍顯紊亂，潮線部分斷裂Mankin評分為(4.1±0.83分)；復元膠囊低劑量組軟骨表層可見少許裂隙，細胞數(shù)減少，排列紊亂，有空泡樣改變出現(xiàn)，潮線稍顯紊亂Mankin評分為(5.6±0.48)分；復元中劑量組軟骨組織染色較均勻，細胞層有增生且細胞數(shù)增多Mankin評分數(shù)為(4.3±0.45)分；復元高劑量組軟骨組織表層尚且光滑平整，細胞有明顯增生，中深層有少量細胞簇聚，可見雙重潮線Mankin評分為(2.4±0.66)分。

2.2免疫組化法檢測軟骨組織中ADAMTS-4、ADAMTS-5的表達 正常組軟骨在表層見少許陽性細胞；模型組及其余各組軟骨組織見不同程度著色，軟骨細胞的胞質(zhì)中可見黃色顆粒著色，ADAMTS-4和ADAMTS-5均主要在胞質(zhì)表達，以表層最為明顯；復元膠囊中劑量組和高劑量組與模型組相比，ADAMTS的表達有明顯減少，尤其以ADAMTS-5最為顯著，且復元高劑量組減少程度顯著(P<0.01)；與抗骨增生膠囊組比較，復元膠囊高劑量組ADAMTS-4及ADAMT-5表達低于抗骨增生膠囊組(P<0.01，P<0.05)。見表2，圖1，圖2。

表2 免疫化檢測軟骨組織中ADMAMTS-4、ADAMTS-5的表達(IOD，±s,n=10)

圖1 各組鼠軟骨組織中ADTS-4表達(DAB，×200)

圖2 各組鼠軟骨組織中ADAMTS-5表達(DAB，×200)

2.3RT-PCR法測定軟骨組織中ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表達 各組軟骨組織提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和擴增后，電泳顯示強弱不等的熒光(圖3)。經(jīng)圖像軟件分析結(jié)果顯示，模型組ADAMTS-4及ADAMTS-5表達顯著增加，與其余各組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與抗骨增生膠囊組比，復元膠囊高劑量組ADAMTS-4和ADAMT-5的mRNA的表達量明顯降低(P<0.05)，而復元膠囊低劑量組和中劑量組表達無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4Western 印跡法測定軟骨組織中ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白表達 與正常組比較，模型組軟骨組織中ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白表達量顯著增高(P<0.01)；ADAMTS-4及ADAMTS-5在抗骨增生膠囊組和復元膠囊各組的蛋白表達量均較模型組顯著降低(P<0.01)，復元膠囊低劑量組和中劑量組較之抗骨增生膠囊組差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，復元膠囊高劑量組的表達量顯著低于抗骨增生膠囊組(P<0.05)。見圖4，表4。

表3 RT-PCR檢測軟骨組織中ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA表達(目的/GAPDH,±s，n=10)

表4 蛋白印跡檢測軟骨組織中ADAMTS-4、ADAMTS-5的蛋白表達(目的/β-ACTIN,±s，n=10)

1.正常組;2.模型組;3.抗骨增生膠囊組;4.復元膠囊低劑量組;5.復元膠囊中劑量組;6.復元膠囊高劑量組

1.正常組;2.模型組;3.抗骨增生膠囊組;4.復元膠囊低劑量組;5.復元膠囊中劑量組;6.復元膠囊高劑量組

3 討 論

在OA病變早期，以細胞外基質(zhì)的降解為主，基質(zhì)主要由膠原和蛋白多糖構(gòu)成，其中蛋白多糖占關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)干重的40%，以軟骨聚集蛋白多糖的形式存在〔10〕。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，只有蛋白多糖降解后Ⅱ型膠原才緩慢降解。MMPs和蛋白聚糖酶均能降解蛋白多糖，其中ADAMTS-4和ADAMTS-5是主要的蛋白聚糖酶〔11〕，ADAMTS-4與ADAMTS-5結(jié)構(gòu)相似，均具有前肽區(qū)、催化區(qū)、解聚素樣區(qū)、血小板凝血酶敏感蛋白樣序列1區(qū)(TSP-1)、半胱氨酸富含區(qū)及間隔區(qū)，其中ADAMTS-5還有一個血小板凝血酶敏感蛋白樣序列2區(qū)(TSP-2)，TSP區(qū)可與ECM結(jié)合，參與蛋白多糖的降解。蛋白聚糖酶可在多個位點裂解蛋白多糖，一是核心蛋白G2-G3的硫酸軟骨素富集區(qū)的4個位點；二是傳統(tǒng)球間區(qū)G1-G2(IGD)的作用位點。Glasson等〔12〕在敲除的ADAMTS-5和ADAMTS-4基因的小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，在炎性和非炎性骨關(guān)節(jié)炎中，敲除ADAMTS-5基因可減少對小鼠軟骨組織中的蛋白多糖的降解，而敲除ADAMTS-4無此作用。Stanton等〔13〕通過在小鼠體內(nèi)和體外實驗中證明去除ADAMTS-5活性能對抗蛋白多糖的降解。隨著基因敲除及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的引入，蛋白聚糖酶對OA病程中蛋白多糖的降解作用得到進一步確定，因此西醫(yī)做出大量的努力用來研發(fā)聚蛋白聚糖酶的小分子抑制劑〔14〕，在治療骨關(guān)節(jié)炎上尋找突破，而在中醫(yī)對OA的治療方面的研究才剛剛起步。

中醫(yī)認為骨關(guān)節(jié)炎屬于“骨痹”范疇。其病因病機為：氣血不足，肝腎虧虛，風寒濕侵入骨髓，痹阻經(jīng)絡導致筋骨失養(yǎng)，證屬肝腎虧虛、氣滯血瘀，治法以補腎壯骨，益氣活血為主。復元膠囊中人參、黃芪益氣活血，具有抗疲勞、抗缺氧、增強機體適應能力的作用；川芎、丹參行氣活血，其有效成分川芎嗪和阿魏酸有改善微循環(huán)的作用，且有研究表明川芎嗪能有效防治骨關(guān)節(jié)炎。鹿茸、淫羊藿補腎壯陽、強筋健骨，有調(diào)節(jié)免疫和促性腺激素樣作用，而研究發(fā)現(xiàn)性激素通過促進軟骨細胞中生長因子的表達，抑制多種炎癥因子的表達 ，影響細胞外基質(zhì)的合成和降解，達到延緩OA的病程進展的作用〔15〕。

本實驗結(jié)果顯示，復元膠囊能夠通過抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5的產(chǎn)生，減少蛋白多糖的降解，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷，延緩0A的發(fā)展進程。

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