向志鋼 楊竹林 劉云貴 周衛(wèi)華

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要前提，研究已經(jīng)證實(shí)微血管密度(MVD)與惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系密切，已成為當(dāng)前腫瘤研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)〔1〕。Survivin是近年發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的新成員，廣泛表達(dá)于多種惡性腫瘤組織中〔2〕。本文HCC組織中Survivin的表達(dá)情況及其與和MVD的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院肝膽胰外科2008年5月至2009年5月手術(shù)切除、術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)為肝細(xì)胞癌(HCC)的40例患者的癌組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)，患者年齡25～73歲(平均47.1)歲；其中男39例，女1例；術(shù)前血清甲胎蛋白(AFP)：陰性6例，陽(yáng)性34例；分化程度：高、中分化23例，低分化17例；肝硬化程度：無(wú)或輕度肝硬化18例，中到重度肝硬化22例；大體形態(tài)：巨塊型35例、彌漫型和結(jié)節(jié)型5例；術(shù)中或病理證實(shí)伴肝內(nèi)或/(和)肝外轉(zhuǎn)移14例；腫塊最大直徑≥ 5 cm 35例，< 5 cm 5例。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行化療和放療，癌腫均順利切除，標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，切片厚4 μm。

1.2主要試劑 兔抗人Survivin多克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG、生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG、ABC試劑盒、DAB-HCl顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。

1.3主要方法

1.3.1免疫組化 ABC免疫組化法檢測(cè)Survivin和CD34表達(dá)情況，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。常規(guī)切片脫蠟至水洗；3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15 min，自來(lái)水沖洗；熱修復(fù)抗原15 min，蒸餾水洗2次；滴加適當(dāng)稀釋(1∶100)的一抗，37℃孵育40 min，4℃冰箱過(guò)夜，PBS洗5 min×3次；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔(羊抗鼠)IgG，37℃孵育40 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min×3次；滴加ABC試劑，37℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次； DAB顯色，室溫下顯色20 min，自來(lái)水洗，蒸餾水洗； 蘇木素復(fù)染1 min，自來(lái)水洗15 min；脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。以0.01 mol/L、pH 7.4 的PBS液替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2結(jié)果判斷 CD34陽(yáng)性結(jié)果判定：以棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或幼稚內(nèi)皮細(xì)胞形成的、染為黃褐色的窄隙狀、囊狀和空泡狀結(jié)構(gòu)即判斷為可計(jì)數(shù)的血管，參照文獻(xiàn)〔3〕報(bào)道的方法計(jì)數(shù)MVD；Survivin的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果判斷：以細(xì)胞質(zhì)或(和)細(xì)胞核中含黃色至棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師分別計(jì)數(shù)20個(gè)高倍鏡視野的陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行評(píng)分，確定陽(yáng)性病例和陰性病例〔4〕。

2 結(jié) 果

2.1Survivin和CD34在HCC中的表達(dá)及MVD CD34 陽(yáng)性染色位于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，癌組織中微血管形態(tài)不規(guī)整，分布不均；Survivin的陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)(圖1)。癌組織中Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率〔26(65.0%)〕和表達(dá)評(píng)分〔(2.45±1.96)分〕及MVD(66.42±11.89)均高于癌旁組織〔11(27.5%)〕、(1.35±1.64)分、(36.56±7.39)，均P<0.01。

2.2癌組織中Survivin的表達(dá)及MVD與HCC病理特征之間的關(guān)系 40例HCC癌組織中，除伴轉(zhuǎn)移病例癌組織中的MVD(72.57±11.26)顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移病例(64.25±12.11)(P<0.05)外；Survivin的表達(dá)及MVD與HCC其他臨床病理特征之間未見任何關(guān)系，見表1。

2.3HCC癌組織中Survivin的表達(dá)與MVD的關(guān)系 等級(jí)相關(guān)分析顯示，HCC癌組織中Survivin的表達(dá)評(píng)分與MVD呈正相關(guān)(r=0.327，P=0.039)。

表1 癌組織中Survivin的表達(dá)及MVD與HCC臨床病理特征之間的關(guān)系±s)

圖1 CD34及Survivin在HCC中的陽(yáng)性表達(dá)(ABC，×200)

3 討 論

Survivin是Altiler等在1997年用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1(EPR-1) cDNA在人類基因組庫(kù)中篩選并分離得到的蛋白，是IAP家族中的重要成員，主要表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，不見于成人終末分化的組織(胸腺除外)，主要參與調(diào)解細(xì)胞的增殖和凋亡，被認(rèn)為是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子〔5，6〕。研究表明，Survivin在大多數(shù)惡性腫瘤中都有表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和腫瘤的血管生成調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，是腫瘤預(yù)后的獨(dú)立判斷指標(biāo)，并有望成為惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)〔2，7〕。本研究說(shuō)明Survivin與HCC的發(fā)生、發(fā)展可能有著密切的關(guān)系。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)情況與HCC主要臨床病理特征之間的關(guān)系，說(shuō)明Survivin在HCC的發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移均有賴于血管的生成， MVD是目前采用最多的檢測(cè)腫瘤血管生成的指標(biāo)，是惡性腫瘤預(yù)后的獨(dú)立判斷指標(biāo)〔1〕。本資料提示MVD高的HCC侵襲力強(qiáng)，容易擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。血管生成是多個(gè)復(fù)雜過(guò)程共同作用完成，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管形成素-1(Ang-1)等起著關(guān)鍵的作用。研究表明，在用VEGF、bFGF、Ang-1等誘導(dǎo)靜止期的內(nèi)皮細(xì)胞分裂時(shí)發(fā)現(xiàn)這些血管形成因子的作用依賴于Survivin的表達(dá)上調(diào)〔8,9〕；聯(lián)合應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)和RNA干擾技術(shù)可降低內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin的表達(dá)，可完全消除VEGF對(duì)腫瘤壞死因子或神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗作用，引起凋亡增加和干擾血管生成〔10〕。本組資料提示Survivin參與了HCC的新生血管生成，在HCC的正性調(diào)控中可能起著重要的作用。

綜上，Survivin在HCC的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，并與HCC的血管生成關(guān)系密切，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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