張秀麗 王 雁 隋愛(ài)華

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266003)

血管性認(rèn)知障礙(VCI)是一種多基因與環(huán)境因素相互作用的疾病，其發(fā)病機(jī)制至今仍 不明。尋找VCI的易感基因，有助于預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)。一氧化氮(NO)是一種多功能血管源性細(xì)胞因子，它可以調(diào)節(jié)血管舒張功能，調(diào)整血壓，參與維持血管穩(wěn)態(tài)、抗血小板聚集和單核細(xì)胞黏附、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等作用。NO是由血管內(nèi)皮細(xì)胞在一氧化氮合酶(NOS)催化作用下合成的，人類(lèi)的NOS存在三種亞型：內(nèi)皮型NOS(eNOS)，神經(jīng)元型NOS(nNOS)和誘導(dǎo)型NOS(iNOS)〔1〕。其中eNOS的表達(dá)直接關(guān)聯(lián)循環(huán)中NO的生成量，影響NO的生物活性〔2〕。所以，eNOS的編碼基因被認(rèn)為是腦血管病的候選基因〔3〕。近幾年有大量研究報(bào)道eNOS基因894G/T位點(diǎn)和eNOS 4b/4a位點(diǎn)多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，如：高血壓〔4，5〕、冠心病〔6〕、腦梗死〔7〕等，但是其與VCI的相關(guān)性研究不多?；诖?，本研究測(cè)定了中國(guó)北方漢族人群eNOS基因894G/T位點(diǎn)和eNOS 4b/4a位點(diǎn)的基因多態(tài)性，試圖分析其與VCI的相關(guān)性，探討eNOS基因在VCI發(fā)病中的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 VCI組來(lái)自2009年1月至2013年1月，我院神經(jīng)內(nèi)科住院及門(mén)診VCI患者146例，男77例，女69例。對(duì)照組為同期我院體檢中心健康體檢者160例，男86例，女74例，該組人群無(wú)肝、腎及血液、自身免疫性疾病，無(wú)腦血管病史。此項(xiàng)研究獲得研究對(duì)象的同意及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 收集每個(gè)人的臨床和生化資料，根據(jù)蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(MoCA)評(píng)分<26分(受教育年限<12年則加1分，以校正文化程度的偏倚)，漢密頓抑郁量表(HAMD)評(píng)分<7分，Hachinski缺血量表評(píng)分>7分篩選VCI患者，并經(jīng)過(guò)至少2名神經(jīng)內(nèi)科專(zhuān)科醫(yī)師確認(rèn)所有量表評(píng)分分值。VCI的診斷依據(jù)Rockwood等〔8〕制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除以下情況：①存在嚴(yán)重軀體疾病和殘疾等影響神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試者；②缺少影像學(xué)資料者；③符合美國(guó)精神疾病統(tǒng)計(jì)和診斷手冊(cè)第四版DSM-Ⅳ抑郁癥和精神病的患者；④其他可能引起認(rèn)知功能障礙的疾病(如腦炎、癲癇、腦外傷、正常顱壓腦積水、內(nèi)分泌疾病、肝腎功能不全、酗酒或者藥物濫用者、維生素缺乏、自身免疫性疾病和腫瘤等)。高血壓患者診斷依據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織(WHO/ISH) 高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn): 在未服抗高血壓藥的情況下, 收縮壓≥140 mmHg 和(或)舒張壓≥90 mmHg,且至少3次非同日血壓達(dá)標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn), 或已確診為高血壓正在服用抗高血壓藥物，排除繼發(fā)性高血壓。

1.3標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象在入院后第2天清晨采取空腹外周靜脈血3 ml，應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。紫外分光法測(cè)定DNA含量。

1.4eNOS894G/T位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè) 引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，上游引物5′-TCCCTGAGGAGGGCATGAGGCT-3′，下游引物5′-TGAGGGTCACACAGGTTCCT-3′。PCR總反應(yīng)體系20 μl，其中上游和下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，Premix Ex Taq10 μl，雙蒸水6 μl。循環(huán)條件為95℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)33次，最后延伸72℃10 min結(jié)束反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物5 μl在BanⅡ內(nèi)切酶(英國(guó)BioLabs公司)作用下進(jìn)行酶切反應(yīng)(37℃水浴8 h)，產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳后行EB染色分析和鑒定eNOS 894G/T基因型。

1.5eNOS 4b/4a位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè) 上游引物5′-AGGCCTATGGTA GTCCTT- 3′，下游引物5′-TCTCTTAGTGTGTGGTCA-3′。PCR反應(yīng)體系同上。循環(huán)條件為95℃預(yù)變性5min，后進(jìn)入循環(huán)98℃預(yù)變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后延伸72℃10 min結(jié)束反應(yīng)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳，并進(jìn)行EB染色分析和鑒定eNOS 4b/4a基因型。

1.6DNA序列測(cè)定 取10%的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)定DNA序列，驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因型。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SSPS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)基因型和等位基因頻率。以單因素方差分析(ANOVA)對(duì)定量資料進(jìn)行比較。以χ2檢驗(yàn)對(duì)定性資料進(jìn)行比較，并驗(yàn)證等位基因是否符合Hardy-Weinberg定律。

2 結(jié) 果

2.1一般臨床資料的比較 兩組在年齡、性別、吸煙、飲酒、糖尿病、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平的比較上沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而在高血壓、血漿高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平比較上存在差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2eNOS 894G/T位點(diǎn)、4b/4a位點(diǎn) 基因型的頻率分布 兩組各多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在eNOS894G/T位點(diǎn),VCI組患者TT基因型頻率顯著高于對(duì)照組(χ2=15.43，P<0.05)，T等位基因頻率也顯著高于對(duì)照組(χ2=15.03，P<0.05)，經(jīng)過(guò)高血壓分層后，在高血壓(+)亞組中，VCI組與對(duì)照組之間的這種差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.71，P<0.05；χ2=6.57，P<0.05)，而在高血壓(-)亞組中，VCI組與對(duì)照組之間雖然存在差異，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.63，P>0.05；χ2=2.68，P>0.05)，見(jiàn)表2,圖1～圖3。在eNOS4b/4a位點(diǎn)，兩組aa基因型和a等位基因頻率的比較中，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.49，P>0.05；χ2=1.35，P>0.05)，見(jiàn)表3，圖4～圖6。

表1 兩組一般臨床資料比較

表2 兩組eNOS 894G/T位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

表3 兩組eNOS 4b/4a位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Mraker:1～4:4個(gè)不同樣本的eNOS 894G/T位點(diǎn)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳條帶，目的片段為248 bp

M：Marker;1～4:TT(248 bp)、GG(163、85 bp)、GT(248、163、85)

圖3 eNOS 894G/T位點(diǎn)片段基因測(cè)序圖

1、3、5:bb基因型(420 bp)；2:ab基因型(420、393 bp)；4:aa基因型(393 bp)

圖5 eNOS 4b/4a 4a片段基因測(cè)序圖

圖6 eNOS 4b/4a 4b片段基因測(cè)序圖

3 討 論

eNOS基因位于人類(lèi)染色體7q35-q36區(qū)，由跨越21 kb的26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，編碼含有4 052個(gè)核苷的mRNA，eNOS主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管組織和血小板等，與心腦血管疾病密切相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)十幾種eNOS基因的多態(tài)性位點(diǎn)，如894G/T、27A/C、786T/C、922A/G、4b/4a等。其中研究主要集中在894G/T位點(diǎn)和4b/4a位點(diǎn)〔4～7,9,10〕。

位于eNOS基因的第7外顯子894位堿基由G到T的突變，可以導(dǎo)致密碼子298位的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘扉T(mén)冬氨酸，從而改變eNOS酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致NO的生物活性下降，NO的生成量減少〔11,12〕。近年來(lái)，關(guān)于eNOS 894G/T位點(diǎn)多態(tài)性的研究較多，Nien-Tsung等〔6〕研究表明eNOS 894G/T位點(diǎn)多態(tài)性與心血管病存在相關(guān)性，心血管病組T等位基因頻率明顯高于對(duì)照組。另有研究證實(shí)eNOS 894G/T多態(tài)性是高血壓的危險(xiǎn)因素〔4，5〕，還與頸動(dòng)脈斑塊的產(chǎn)生相關(guān)，是頸動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素〔7〕。

上述疾病均與VCI的發(fā)病相關(guān)，但目前關(guān)于eNOS 894G/T位點(diǎn)多態(tài)性與VCI關(guān)系的報(bào)道較少。Morris等〔9〕研究表明，eNOS 894G/T位點(diǎn)的TT基因型可以增加卒中后癡呆的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，T等位基因可能是其易感基因。本研究結(jié)果顯示：VCI組含T等位基因的頻率明顯高于對(duì)照組，因此，我們認(rèn)為T(mén)等位基因可能是VCI的易感基因，突變純合子TT基因型的出現(xiàn)會(huì)增加VCI的遺傳易感性。這與國(guó)內(nèi)江意春等〔10〕的研究結(jié)果相一致。

Gabrille等〔13〕認(rèn)為VCI理想的易感基因具備以下兩點(diǎn)：(1)與高血壓、頸動(dòng)脈粥樣硬化等血管性疾病相關(guān)的基因。(2)直接影響腦對(duì)血管疾病反應(yīng)如缺血耐受性和神經(jīng)可塑性等的基因。我們的研究進(jìn)一步經(jīng)高血壓分層后發(fā)現(xiàn)，在高血壓(-)的亞組中，VCI組含T等位基因的頻率亦明顯高于對(duì)照組；而在高血壓(-)亞組中，不存在此種差異，提示eNOS 894G/T位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)VCI的影響與高血壓相關(guān)。目前關(guān)于VCI的發(fā)病機(jī)制仍不明，既往研究多認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與長(zhǎng)期慢性腦的低灌注以及缺血再灌注有關(guān)〔14〕。我們的研究結(jié)果提示：eNOS894G/T位點(diǎn)的突變導(dǎo)致eNOS的功能受損,產(chǎn)生的NO減少, 影響血管內(nèi)皮功能，引起血管緊張性增高而導(dǎo)致高血壓。而長(zhǎng)期的高血壓加速了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，血管阻力增加，腦血流減少，使大腦處于長(zhǎng)期慢性的低灌注狀態(tài)，最終影響認(rèn)知功能。

位于eNOS基因第4內(nèi)含子基因數(shù)目可變性串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)多態(tài)性位點(diǎn)，它是以27 bp為核心數(shù)目的可變性串聯(lián)重復(fù)序列(eNOS 4b/4a)，該位點(diǎn)的多態(tài)性同樣會(huì)影響eNOS酶的功能，以及NO的生物活性〔11〕。研究表明，eNOS 4b/4a位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病〔15〕和高血壓〔5,16〕存在相關(guān)性，a等位基因是其易感基因。但是，在本研究人群中，VCI組含a等位基因的頻率雖然高于對(duì)照組，但是差異不具顯著性，可能與樣本量小，存在誤差有關(guān)，有待于擴(kuò)大樣本進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)VCI患者等位基因T頻率升高，G頻率降低，說(shuō)明等位基因T可能是中國(guó)人VCI的危險(xiǎn)因素之一。并且我們推測(cè)eNOS 894G/T位點(diǎn)多態(tài)性通過(guò)影響高血壓而間接影響認(rèn)知功能。因此，對(duì)VCI的高危人群，進(jìn)行eNOS基因型的檢測(cè)，以及良好的控制高血壓，可能在一定程度上預(yù)防VCI的發(fā)病。

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