賈秋穎

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130000)

近年國外對心肺復(fù)蘇(CPR)后心臟、大腦單個器官研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，CPR后引起器官急性損傷的原因很多，但主要為心跳驟停期間組織嚴(yán)重缺血缺氧以及復(fù)蘇后組織再灌注所致，也稱再灌注損傷，缺血再灌注可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，過度炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致多器官功能障礙，出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征(MODS)。多器官功能衰竭(MOF)是危重病患者主要死亡原因，目前CPR后多器官損傷的研究甚少，本實驗采用SD大鼠心跳驟停-CPR模型，了解復(fù)蘇后多器官組織細胞(心肌細胞、腦神經(jīng)細胞、腎小管上皮細胞)超微結(jié)構(gòu)的損傷，并用改善線粒體能量代謝的藥物氧化樟腦進行干預(yù)，評價氧化樟腦防治復(fù)蘇后多器官組織細胞急性損傷的效果，為臨床防治MODS/MOF尋找新的有效藥物。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 雄性健康(SD)大鼠24只，體重(274.96±29.59)g，日齡49～60 d，由中國科學(xué)院上海分院實驗動物中心提供。將SD大鼠隨機分為：對照組、常規(guī)復(fù)蘇組、氧化樟腦治療組。

1.2CPR模型的制備 術(shù)前禁食12 h，頸部正中切口，行氣管插管，分別于左側(cè)頸外靜脈、右側(cè)頸總動脈置管，監(jiān)測動脈及血壓，心電圖及直腸溫度。操作完成并穩(wěn)定30 min后經(jīng)頸靜脈注射肌松劑(琥屋后 酰膽堿，0.15 mg/100 g)抑制呼吸合并0.5 mol/L冰氯化鉀(4℃，0.12 ml/100 g)停跳液致致大鼠心跳驟停 ，持續(xù)5 min后行CPR，出現(xiàn)自主心律、脈搏波、收縮壓≥60 mmHg，持續(xù)10 min以上判定為自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)，2 h后逐步撤離呼吸機，拔除氣管插管和動靜脈導(dǎo)管并縫合傷口。氧化樟腦治療組于心跳恢復(fù)時給予氧化樟腦(按2支/10 ml)生理鹽水稀釋后腹腔注入，復(fù)蘇后12 h再給同等劑量，常規(guī)組腹腔注射生理鹽水0.3 ml，對照組僅進行插管等手術(shù)操作，不進行心跳驟停和心肺復(fù)蘇。所有實驗參數(shù)設(shè)計和記錄均參照實驗研究的Utstein模式〔2〕。

1.3標(biāo)本采集 術(shù)后24 h采血，并取左心室心肌、左側(cè)顳葉皮質(zhì)區(qū)腦皮質(zhì)、左腎上極髓質(zhì)組織，用銳利刀片切成1 mm3大小3塊，放入2.5%戊二醛液中固定冷藏，用于透射電鏡觀察組織細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.4電鏡標(biāo)本檢測2.5%戊二醛預(yù)固定，0.1 mol/L PBS液漂洗，2%鋨酸后固定2 h，酒精丙酮梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹脂埋，制備半薄切片定位后，超薄切片用醋雙氧鈾和檸檬酸染色，日立HE-800透射電鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1心肌細胞透射電鏡(TEM)結(jié)果 對照組(圖1A)心肌細胞結(jié)構(gòu)正常：核位于中央，染色質(zhì)分布均勻，線粒體呈短粗狀，嵴排列整齊，心肌纖維排列規(guī)則。而常規(guī)復(fù)蘇組(圖1B)可見明顯心肌細胞損傷，細胞正常形態(tài)消失，核變形、溶解，線粒體腫脹、嵴斷裂、甚至空泡化，心肌纖維斷裂，排列紊亂，部分肌絲溶解。氧化樟腦治療組(圖1C)心肌細胞核形態(tài)基本正常，少數(shù)細胞線粒體腫脹、部分心肌纖維斷裂，排列尚規(guī)則有序。

2.2腦細胞TEM結(jié)果 對照組(圖2A)腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常：核位于中央，染質(zhì)分布均勻，線粒體峭排列整齊，核糖體清晰可見。而常規(guī)復(fù)蘇組(圖2B)可見明顯神經(jīng)元損傷，正常形態(tài)消失，核變形、固縮，線粒全腫脹、嵴斷裂、甚至空泡化，胞漿空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，部分神經(jīng)元脫髓鞘。氧化樟腦治療組(圖2C)神經(jīng)元形態(tài)基本正常，僅見少數(shù)細胞線粒體脹。

2.3腎臟組織細胞TEM結(jié)果 對照組(圖3A)腎小管上皮細胞排列整齊，細胞核橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，線粒體嵴排列整齊，無斷裂，胞漿中可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體。而常規(guī)復(fù)蘇組(圖3B)可見腎小管細胞損傷明顯，正常形態(tài)消失，可見凋亡小體，線粒體腫脹、嵴斷裂、部分線粒體空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，內(nèi)池分離。氧化樟腦治療組(圖3C)腎小管細胞基本完整，少數(shù)細胞線粒體腫脹。

圖1 心肌細胞TEM結(jié)果

圖2 腦細胞TEM結(jié)果

圖3 腎臟組織細胞TEM結(jié)果

3 討 論

本次研究結(jié)果提示心肺復(fù)蘇后SD大鼠心、腦、腎細胞出現(xiàn)急性損傷，而氧化樟腦可減輕心、腦、腎細胞急性損傷。缺血再灌注的概念首先由Jennings于1960年提出，但缺血再灌注損傷的發(fā)生機制至今尚未完全闡明，目前認(rèn)為能量代謝障礙是其發(fā)病的基礎(chǔ)，自由基的作用和細胞內(nèi)鈣超載是其重要發(fā)病環(huán)節(jié)。器官、組織缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)細胞凋亡與壞死，此過程首先是通過線粒體水平-系列復(fù)雜的變化發(fā)生的，包括三羧酸循環(huán)障礙、氧自由基的產(chǎn)生、膜通透性的改變、鈣向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移、凋亡因子的釋放等〔3〕。Milei等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后心肌超微結(jié)構(gòu)有明顯變化，在線粒體水平變化尤其顯著，此變化主要與氧化應(yīng)激有關(guān)。大腦缺血后最初的超微結(jié)構(gòu)改變是線粒體腫脹，這在80年代就有報道。

目前有關(guān)于線粒體在決定腦細胞死亡和再灌注損傷中潛在作用的研究〔5～7〕，發(fā)現(xiàn)再灌注可產(chǎn)生快速的線粒體損傷，包括線粒體裂解、濃縮、基質(zhì)密度改變等。Friberg〔8〕研究認(rèn)為再灌注時神經(jīng)細胞暴露于氧自由基、炎性介質(zhì)中，氧化應(yīng)激反應(yīng)使得線粒體受到極度損傷。Benftez-bribiesca〔2〕發(fā)現(xiàn)早期缺血再灌注及組織供氧不足誘導(dǎo)了凋亡，最早的超微結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在線粒體，線粒體腫脹，嵴斷裂，膜滲漏。本研究與以上研究結(jié)果相一致，不同的是，本實驗同時觀察了心、腦、腎多個器官超微結(jié)構(gòu)的變化，而且發(fā)現(xiàn)在心肺復(fù)蘇后24 h，這些器官線粒體幾乎發(fā)生了同樣的超微結(jié)構(gòu)病理改變。氧化樟腦具有減輕心肺復(fù)蘇后多器官組織細胞急性損傷、保護多器官組織細胞超微結(jié)構(gòu)完整的作用。

4 參考文獻

1Peitzman AB,Billiar TR.Hemorrhagic shock〔J〕. Curr Probl Surg,2000;32(11):925-1102.

2Benftez-bribiesca L,Comez-camarillo M,Castellanos-juarez E,etal. Morphologic, biochemical and molecular mitochondrial changes during reperfusion phase following brief renal ischemia〔J〕. Ann N Y Aca Sci,2000;926:165-79.

3Spielmeyer W. In:Histopathologie des Nervensystems〔J〕. Berlin:Springer,1922:74-9.

4Milei J,Fraga CG,Grana DR,etal. Ultrastructural evidence of increased tolerance of hibernating myocardium to cardioplegic ischemia-reperfusion injury〔J〕. J Am Coll Cardiol,2004 Jun;16;43(12):2329-36.

5Jassem W, Fuggle SV, Rela M,etal. The role of mitochondria in ischemia/reperfusion injury〔J〕. Transplantation,2002;73(4):493-9.

6Waterhouse NJ. The cellular energy crisis:mitochondria and cell death〔J〕. Med Sci Sports Exer,2003;35(1):105-10.

7Kim JS, He L, Lemasters JJ. Mitochondrial permeability transition: a common pathway to necrosis and apoptosis〔J〕. Biochem Biophys Res Comm,2003;304(3):463-70.

8Friberg H, Wieloch T, Castilho RF. Mitochondrial oxidative stress after global brain ischemia in rats〔J〕. Neurosci Lett,2002;334(2):111-4.