李凱軍 胡江平

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

過度磷酸化的tau蛋白與阿爾茨海默病(AD)的形成和發(fā)展有著密切的聯(lián)系〔1〕。岡田酸(OA)是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，能抑制磷酸酯酶的活性，使蛋白高度磷酸化，并可以引起氧化損傷，在離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中能夠誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化；同時，OA在體內(nèi)能促進Aβ沉積，造成神經(jīng)元退化，突觸缺失及記憶障礙，產(chǎn)生類AD樣病理特征。雌激素(E2)在AD的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起到十分重要的作用。E2可通過多種方式發(fā)揮其對AD的保護作用，如促進神經(jīng)突觸生長和重塑、參與中樞神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)、減少β淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積、抗氧化和抗自由基作用、維持胞內(nèi)鈣的平衡、調(diào)節(jié)載脂蛋白E(ApoE)的表達等，但對細胞tau蛋白磷酸化的影響尚未見報道。絕經(jīng)后婦女AD的發(fā)病率較同年齡組的男性高2～3倍，由于女性絕經(jīng)后雌激素水平急劇降低，而同齡男性產(chǎn)生的睪丸酮在腦內(nèi)經(jīng)P-450芳香化酶作用可轉(zhuǎn)變成雌激素〔2〕。流行病學(xué)研究亦證實AD的發(fā)病與絕經(jīng)后婦女喪失雌激素的保護作用有關(guān)〔3〕。本研究觀察E2對OA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所，小鼠抗p-tau (Thr231) 購自美國Invitrogen公司，小鼠抗GAPDH抗體購自Kangchen公司，PVDF膜購自美國Millpore公司，蛋白Marker購自NEB公司，ECL試劑盒購自美國Pierce公司，OA購自美國Santa cruz公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，多聚賴氨酸購自武漢博士德生物公司，DMSO購自美國Sigma公司，胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2實驗分組 常規(guī)細胞培養(yǎng)后，分為六組，V為空白對照組，C為OA處理組，T1、T2、T3、T4分別為10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L OA+E2處理組。SH-SY5Y細胞經(jīng)40 mmol/L OA處理12 h后，加入不同濃度的E2(T1，T2，T3，T4分別為10 nmol/L,100 nmol/L,1 μmol/L,10 μmol/L)作用6 h，提取細胞蛋白，檢測總tau和p-tau在Thr231位點的表達水平。

1.3細胞培養(yǎng) 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱中37℃，5% CO2，100%濕度靜置培養(yǎng)。

1.4MTT測定 細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單細胞懸液，每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板，移入培養(yǎng)箱，待細胞完全貼壁后，每孔加入含有OA的培養(yǎng)液，濃度分別為10，20，40，80，160 nmol/L，對照組加等體積的培養(yǎng)液。每種濃度6個復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后，每孔加入MTT(5 mg/ml) 20 μl，繼續(xù)孵育3 h，棄上清，每孔加DMSO 150 μl，在水平搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標儀測定光密度值(490 nm)。

1.5Western印跡檢測 收集細胞后提取蛋白、測定濃度，經(jīng)灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗及二抗孵育后，應(yīng)用HRP-ECL發(fā)光法檢測蛋白，用BIO-RAD凝膠電泳圖像分析儀進行圖像采集，Quantity One軟件進行圖像分析。

2 結(jié) 果

2.1OA對SH-SY5Y細胞活力的影響 SH-SY5Y細胞經(jīng)不同濃度OA處理12 h后，測定OD值，以正常對照組細胞活力為100%，其余各組OD值與之相比得到各自的細胞活力。我們選擇細胞活力在80%以上的藥物濃度處理細胞。10、20、40、80、160 nmol/L OA組細胞活力為(92.57%±13.95%)(87.48%±14.58%)(80.48%±11.93%)(60.58%±5.69%)(45.42%±4.36%)。當(dāng)OA濃度大于40 nmol/L時，細胞活力受到明顯的抑制，且隨著OA濃度的增加而增強，而低于此濃度的OA對細胞活力沒有明顯的影響。

2.2E2對OA處理的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響 Western印跡結(jié)果顯示，C與V組相比，tau蛋白磷酸化的水平明顯增加(185.41%±8.06% vs 100%±5.92%,P<0.05)，而T1、T2、T3、T4組tau蛋白磷酸化水平都明顯降低〔(141.91±3.73)%、(116.63±6.55)%、(110.04±6.32)%、(94.58±6.21)%〕。T4組的tau蛋白磷酸化水平與C組相比降低了90.8%(P<0.05)，與V組水平無明顯差異，光密度值以GAPDH作為內(nèi)參校正。見圖1。

圖1 E2對OA處理的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響

3 討 論

Tau蛋白的正常功能是促進微管蛋白組成微管，并維持微管的穩(wěn)定性。微管參與維持細胞形態(tài)、信息傳遞、細胞分裂等重要生物學(xué)過程，AD的重要病理變化之一是神經(jīng)細胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，其主要成分就是過度磷酸化的tau蛋白〔4〕，在AD腦組織中，異常過度磷酸化的tau蛋白含量顯著增高，并聚集成雙螺旋細絲(PHFs)，tau磷酸化程度的增加使tau結(jié)合微管的能力下降，從而喪失了促進微管組裝的生物活性，導(dǎo)致細胞骨架的結(jié)構(gòu)異常和神經(jīng)細胞死亡。AD患者腦的tau蛋白異常過度磷酸化，每分子tau蛋白可含5～9個磷酸基，目前發(fā)現(xiàn)，AD患者有21個異常磷酸位點,多個磷酸位點的磷酸化更易導(dǎo)致tau蛋白的微管結(jié)合功能喪失,其中研究較多的有181、199、231、396及404等多個磷酸化位點,已在AD患者的腦脊液中檢測到高濃度上述位點的p-tau蛋白,并具有較高的特異性和敏感性,因此，本實驗選取Thr231位點進行檢測。

OA是一種海洋生物提取物，對蛋白磷酸酶PP2A和PP1具有抑制作用，從而阻止tau蛋白的去磷酸化〔5〕，OA能使神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白tau異常過度磷酸化，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，包括產(chǎn)生AD樣的病理過程。因此我們選用它來制造AD時tau蛋白過度磷酸化的細胞模型。MTT表明OA濃度大于40 nmol/L時，細胞活力受到明顯的抑制，因此選擇40 mmol/L OA處理12 h作為制備AD時tau蛋白過度磷酸化的細胞模型時OA最佳作用濃度和作用時間。

雌激素是類固醇類激素，它主要是由性腺產(chǎn)生，包括體內(nèi)有雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和雌酮(E1)3種類型。其中E2的生物活性最強，AD患者腦中的類固醇激素水平，與比正常人相比普遍降低，并發(fā)現(xiàn)神經(jīng)類固醇激素的含量與AD的兩大生物化學(xué)特征顯著相關(guān)〔6〕，即與過度磷酸化tau蛋白(形成PHF-tau)和β淀粉樣肽相關(guān)。雌激素的長期缺乏將影響神經(jīng)功能，與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Twist等〔7〕用放免法對照測定AD病人和正常老年人腦中E2的含量，發(fā)現(xiàn)正常男性腦中的E2的量比正常女性高3.5倍，而AD患者中男女E2的比例沒有明顯的不同。對大量人群的回顧性及前瞻性研究和體外實驗表明，雌激素替代療法(ERT)不僅對AD的治療有效，而且能預(yù)防AD的發(fā)病和推遲發(fā)病年齡〔8〕。

本實驗表明E2對tau蛋白磷酸化有明顯的抑制作用，說明E2對AD的治療具有積極的作用，其機制很可能是通過減少tau蛋白磷酸化水平而發(fā)揮作用的。

4 參考文獻

1Hu JP，Xie JW，Wang CY,etal.Valproate reduces tau phosphorylation via cyclin-dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase 3 signaling pathways〔J〕.Brain Res Bull，2010；85(3-4)：194-200.

2Lahiri DK.′Current Alzheimer Research′：update on lipids，estrogen，neurotrophins and their roles in neurodegeneration〔J〕.Curr Alzheimer Res，2008；5(1)：1-3.

3Waring SC，Rocca WA，Petersen RC,etal.Postmenopausal estrogen replacement therapy and risk of AD：a population-based study〔J〕.Neurology，1999；52(5)：965-70.

4Grundke-Iqbal I，Iqbal K，Tung YC,etal.Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1986；83(13)：4913-17.

5Planel E，Yasutake K，F(xiàn)ujita SC,etal.Inhibition of protein phosphatase 2A overrides tau protein kinase I/glycogen synthase kinase 3 beta and cyclin-dependent kinase 5 inhibition and results in tau hyperphosphorylation in the hippocampus of starved mouse〔J〕.J Biol Chem，2001；276(36)：34298-306.

6Rosario ER,Carroll J，Pike CJ.Testosterone regulation of Alzheimer-like neuropathology in male 3xTg-AD mice involves both estrogen and androgen pathways〔J〕.Brain Res，2010；1359：281-90.

7Twist SJ,Taylor GA，Weddell A,etal.Brain oestradiol and testosterone levels in Alzheimer′s disease〔J〕.Neurosci Lett，2000；286(1)：1-4.

8Ohkura T，Isse K，Akazawa K,etal.Evaluation of estrogen treatment in female patients with dementia of the Alzheimer type〔J〕.Endocr J，1994；41(4)：361-71.