王玲玲 吳 雷 孫博謙

(北華大學附屬醫(yī)院神經內科，吉林 吉林 132001)

隨著2型糖尿病(T2DM)發(fā)病率的逐年攀升，且因長期進行胰島素皮下注射給患者帶來的負擔，口服胰島素的研發(fā)成為目前一項新的研究熱點。本課題組受中醫(yī)治消渴組方啟發(fā)，確定了蠶蛾的抗糖尿病(DM)作用。經前期研究結果推測蠶蛾可能是通過家蠶素Ⅱ(BbxⅡ)發(fā)揮其抗DM作用。為進一步明確BbxⅡ對哺乳細胞的胰島素樣作用，本研究應用穩(wěn)定表達BbxⅡ基因的人肝細胞株(HepG2)細胞，在體外觀察BbxⅡ對HepG2細胞的胰島素樣作用，為明確BbxⅡ對哺乳動物細胞的降糖作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 穩(wěn)定轉染pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His質粒 HepG2細胞株，穩(wěn)定轉染 pcDNA3.1(+)空質粒 HepG2細胞株、未進行轉染HepG2細胞株及人胰島素均由中日聯(lián)誼醫(yī)院中心實驗室提供。高糖DMEM、無酚紅1640培養(yǎng)液、優(yōu)質胎牛血清、胰酶均由美國GIBCO公司購入?？笻is-tag小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠購自中國碧云天生物技術公司。葡萄糖測定試劑盒、糖原染液試劑盒購自北京天根生物技術公司。

1.2實驗方法 (1)免疫細胞化學檢測細胞中重組Bbx(MBbxⅡ)蛋白表達。(2)葡萄糖氧化酶-過氧化物酶(GOD-POD)法測定葡萄糖消耗：①制單細胞懸液，按1×104/孔分別種植于96孔板，每組細胞設5復孔。實驗分組：A組： pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His HepG2，B組：空質粒pcDNA3.1(+)HepG2，C組：未轉染HepG2細胞， D組：10 nmol/L人胰島素作用HepG2細胞，E組：100 nmol/L人胰島素作用HepG2細胞?？装逯糜?7℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞貼壁達80%融合后進行實驗。實驗前24 h開始，細胞培養(yǎng)液更換為不含酚紅1640培養(yǎng)液，其他成分不變。實驗開始時D組及E組加入相應的人胰島素，作用24 h及48 h。②葡萄糖消耗實驗步驟：每孔分別取細胞培養(yǎng)液2 μl，與工作液100 μl混合均勻，置于新96孔板中。設校準對照孔(陽性對照)及空白對照孔(陰性對照)。37℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min。取出96孔板,使用酶聯(lián)免疫分析儀在505 nm波長處讀取各孔吸光度值；計算葡萄糖濃度。(3)PAS染色方法測定細胞糖原合成：①實驗分組：A組： pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His HepG2；B組：空質粒pcDNA3.1(+) HepG2；C組：未轉染HepG2細胞；D組：10 nmol/L人胰島素作用HepG2細胞；E組：100 nmol/L人胰島素作用HepG2細胞。②24孔板中放置高壓滅菌的蓋玻片，按2×104個/孔均勻接種細胞，每孔加入1 ml細胞培養(yǎng)液并保持G418相應濃度，37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合達90%以上時進行后續(xù)實驗。實驗開始當日D組、E組HepG2細胞分別加入相應濃度人胰島素作用，37℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。③細胞糖原染色實驗步驟：0.1 mol/L磷酶鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，加入固定液10 min，水洗1 min，晾干；試劑一全部覆蓋整個蓋玻片，室溫避光孵育10 min；取出蓋玻片緩慢沖洗3 min；玻片未干之前，滴加試劑二于蓋玻片樣本上，覆蓋樣本，室溫孵育15 min；取出蓋玻片，緩慢沖洗60 s，自然晾干；滴加試劑三染色30 s，流水沖凈、晾干；中性樹膠封片，高倍鏡鏡檢。

2 結 果

2.1免疫細胞化學檢測MBbxⅡ基因在HepG2蛋白水平的表達結果 以細胞內已穩(wěn)定轉染BbxⅡ基因所含有的6個his-tag為抗原，對三組HepG2細胞分別進行免疫細胞化學檢測，結果顯示：穩(wěn)定轉染pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His組HepG2細胞胞漿中可以見到棕黃色的顆粒，穩(wěn)定轉染空質粒pcDNA3.1(+)組及未轉染組HepG2細胞胞漿中未見到。結果說明pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His質粒在HepG2細胞中得到穩(wěn)定轉染并可實現(xiàn)表達。見圖1。

A：基因未轉染組； B：pcDNA3.1(+)空質粒穩(wěn)；C：pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His組定轉染組

2.2MBbxⅡ基因對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響 培養(yǎng)細胞換液24 h后檢測葡萄糖消耗情況，與基因未轉染組及空質粒轉染組HepG2細胞比較pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組及100 nmol/L胰島素作用HepG2細胞組，葡萄糖消耗增多，差異有顯著性(P<0.01)。與基因未轉染組及空質粒轉染組HepG2細胞比較10nM胰島素作用HepG2細胞組，差異顯著(P<0.05)。pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組、10 nmol/L及100 nmol/L胰島素作用HepG2細胞組進行兩兩比較，無顯著性差異(P>0.05)。

培養(yǎng)細胞換液48 h后檢測葡萄糖消耗情況，與基因未轉染組及空質粒轉染組HepG2細胞比較pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組及100 nmol/L胰島素作用HepG2細胞組，差異顯著(P<0.01)。與基因未轉染組及空質粒轉染組HepG2細胞比較10 nmol/L胰島素作用HepG2細胞組，差異顯著(P<0.05)。pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組與100 nmol/L胰島素作用HepG2細胞組進行比較，無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 MBbxⅡ基因對HepG2細胞葡萄糖攝取影響

2.3MBbxⅡ基因對HepG2細胞糖原合成作用的影響 與正常組及轉染空質粒pcDNA3.1(+)-HepG2組比較，pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組及100 nmol/L胰島素作用組HepG2細胞的糖原合成均有增加(P<0.01)。與正常組及轉染空質粒pcDNA3.1(+)-HepG2組比較，10 nmol/L胰島素作用組HepG2細胞的糖原合成增加(P<0.05)。而pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組及100 nmol/L胰島素作用組間比較無顯著性差異(P>0.05)。見圖2，表2。

表2 MBbxⅡ對HepG2細胞糖原合成的影響(n=30,n/n)

圖2 MBbxⅡ對HepG2細胞糖原合成的影響(PAS染色，400×)

3 討 論

在人類胰島素調節(jié)血糖的過程中，肝臟是最重要的靶器官。肝臟通過控制糖原的合成與分解，控制著糖異生等途徑，維持血糖的穩(wěn)定。葡萄糖攝取及糖原合成是研究肝細胞糖代謝中最重要的兩個指標〔1，2〕。HepG2細胞是一種肝癌細胞株，常作為體外研究肝細胞糖代謝的細胞模型〔3，4〕。檢測葡萄糖消耗的方法有：3H標記 2- DOG攝取試驗、放射性核素14C標記葡萄糖摻合試驗及14C標記葡萄糖合成糖原試驗等。這些方法雖都能反映糖代謝的動態(tài)變化過程，并且靈敏度較高，但均存在放射線侵害，易污染環(huán)境，價格昂貴，需要特定儀器及場地等缺點。本研究說明MBbxⅡ具有促進肝細胞葡萄糖攝取能力但其作用可能是快速反應并且在短期內滅活，這與近期關于家蠶素的一項研究結果相一致〔5〕。

肝臟細胞糖代謝的另外一個重要的功能是合成與存貯糖原。本研究在上述實驗研究結果的基礎上，應用糖原染色檢測MBbxⅡ對HepG2細胞的糖原合成調節(jié)。實驗結果從另一方面證實了MBbxⅡ具有調節(jié)肝細胞糖代謝的功能。

胰島素是機體內唯一可降低血糖的激素，也是唯一同時可促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素。胰島素除了對糖、脂肪和蛋白質的代謝起調節(jié)作用外，還可刺激DNA及蛋白質的合成，促進細胞生長。MBbxⅡ作為胰島素家族成員，是否存在促進細胞增殖能力仍未明確。從昆蟲遺傳學角度研究發(fā)現(xiàn)其具有促進造血器官細胞增殖〔6，7〕以及卵巢發(fā)育〔8～10〕等生理功能。但關于MBbxⅡ對哺乳動物細胞是否具有同樣的促進細胞增殖能力未見報道。

4 參考文獻

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