程 淼 張新芳 張 潔 蔡圣榮 周傳云 翟從永 盛東亞 劉 睿 劉自兵

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院針灸經(jīng)絡(luò)研究所，安徽 合肥 230038)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，氣流受限并呈進(jìn)行性發(fā)展，其反復(fù)發(fā)作將損害機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能，而免疫功能低下可使呼吸道感染率和病死率明顯增加〔1〕。輔助性T淋巴細(xì)胞(T cell helper，Th)亞群與COPD的發(fā)生具有重要關(guān)系〔2，3〕。最近有人觀察到COPD患者存在Th1/Th2平衡失調(diào)〔4〕。在正常情況下，Th1/Th2 細(xì)胞處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，但機(jī)體發(fā)生功能異常時(shí)，常表現(xiàn)出平衡偏向其中一方，此即為“Th1/Th2平衡漂移”。一旦Th1/Th2 之間的平衡狀態(tài)被打破，很可能造成人體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，進(jìn)而引起許多疾病的產(chǎn)生和發(fā)展。故在綜合治療COPD的同時(shí)，積極有效地改善COPD患者體內(nèi)的免疫平衡狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，對(duì)減慢病程進(jìn)展、提高患者生活質(zhì)量尤為重要。臨床觀察和大量實(shí)驗(yàn)研究資料證實(shí)針刺具有調(diào)整和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，從而起到防病、治病“扶正固本”的功效〔5〕。但針刺是否能調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡失調(diào)，尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電針COPD模型大鼠，檢測(cè)外周血漿及肺泡灌洗液中IFN-γ和IL-4的含量，分析針刺對(duì)Th1/Th2平衡失調(diào)的調(diào)節(jié)作用，為臨床應(yīng)用針刺治療COPD，改善免疫功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物分組及模型復(fù)制 實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)Sprague-Dawley 雄性大鼠40只，購(gòu)自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司〔許可證號(hào)：SCXK(滬)2008-0016，合格證號(hào)：2008001619110〕，體重為160～180 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、電針7次組和電針14次組，每組10只。COPD模型大鼠的造模方法參照文獻(xiàn)并進(jìn)行了改良〔6〕：將模型和電針組30只大鼠于煙熏前1 d及煙熏第15天，以6%水合氯醛麻醉，頸部切口，分離氣管，以1 ml注射器氣管內(nèi)注射濃度1 mg/ml的脂多糖溶液，200 μg/鼠，術(shù)后40萬(wàn)單位青霉素抗炎。煙熏時(shí)，將大鼠置于自制1 m3的煙熏箱內(nèi)，將30支紅三環(huán)牌香煙(焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.8 mg/支，煙氣一氧化碳量15 mg；安徽中煙工業(yè)公司)點(diǎn)燃放入箱內(nèi)，每天下午4點(diǎn)進(jìn)行煙熏，每日45 min，自由進(jìn)食進(jìn)水，連續(xù)煙熏12 w。對(duì)照組大鼠呼吸潔凈空氣。

1.2電針方法 煙熏第9周開始，電針組大鼠在煙熏前接受電針治療，大鼠以6%的水合氯醛輕度麻醉(240 mg/kg，低于正常麻醉劑量420 mg/kg)，適當(dāng)刺激大鼠尚能爬行，針刺結(jié)束時(shí)大鼠即可自由活動(dòng)。穴位取雙側(cè)足三里(ST36，即后三里，定位于大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下方5 mm，脛腓骨間隙處)、肺俞穴(BL13，定位于大鼠背部第三胸椎下兩旁肋間)〔5〕，針灸針柄以導(dǎo)線聯(lián)接華佗牌SDZ-V型程控多功能電針治療儀(蘇州產(chǎn))，參數(shù)采用4/20 Hz交替頻率，強(qiáng)度為1級(jí)(相當(dāng)于2 mA)，以引起大鼠后肢輕微抖動(dòng)為度。下午2點(diǎn)進(jìn)行針刺，每次電針治療30 min，隔日1次，分別連續(xù)針刺治療7次和14次，正常對(duì)照及模型組大鼠均以等劑量麻醉而不針刺。

1.3觀察肺功能和肺組織病理 針刺結(jié)束后次日，以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠(70 mg/kg)，氣管插管后置于大鼠體描箱，接好導(dǎo)管，連接呼吸機(jī)、呼吸信號(hào)調(diào)理器及負(fù)壓器，開啟計(jì)算機(jī)，打開AniRes2005動(dòng)物肺功能分析軟件(北京貝蘭博科技公司)，記錄吸氣阻力(Ri)、呼氣阻力(Re)和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cydn)。大鼠處死后取肺組織，常規(guī)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，采用奧林巴斯BX51型光學(xué)顯微鏡，取200倍視野觀察并攝片。

1.4ELISA方法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液及血漿IFN-γ和IL-4含量 血漿采集方法：肺功能檢測(cè)結(jié)束后，以采血針取大鼠腹主動(dòng)脈血置于抗凝管，4℃ 3 000 r/min離心(長(zhǎng)沙湘儀TGL-16M型臺(tái)式冷凍離心機(jī))15 min，取上清。支氣管肺泡灌洗液(BALF)抽取方法：大鼠取血后開胸，分離縱隔，止血鉗鉗住右總支氣管，注射器分兩次抽取3 ml生理鹽水從氣管插管推入左肺，每次反復(fù)灌洗3下后抽出灌洗液，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)BALF及血漿中IFN-γ和IL-4，試劑盒購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司(IL-4批號(hào)：12889R；INF-γ批號(hào)：12562R)，操作程序嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。主要步驟為：①標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋；②加樣；③配液；④洗滌；⑤顯色；⑥終止；⑦以BIO-RAD公司iMARK型號(hào)酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)的吸光度(OD值)；8)計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

2 結(jié) 果

2.1針刺對(duì)COPD模型大鼠肺功能和肺病理的影響 在肺功能的指標(biāo)中，模型組大鼠的呼氣阻力比正常對(duì)照組升高(P<0.05 )，但吸氣阻力及肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明模型大鼠有呼氣受限；針刺7次后，吸氣和呼氣阻力均比模型組顯著下降(P<0.01 )，且肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性顯著增加(P<0.01)，表明針刺顯著改善了肺通氣功能。與針刺7次相比，針刺14次后吸氣阻力的降低和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性增加的幅度均較低(P<0.05 )，說(shuō)明針刺7次即能改善模型大鼠的肺功能。見表1。光鏡下觀察肺病理結(jié)果可見，對(duì)照組大鼠肺泡、肺間隔及小氣道結(jié)構(gòu)完整、清晰、勻稱；模型組肺間隔增厚，且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡減少，小氣道管腔有大量黏液分泌及堵塞，管壁變形及增厚；電針后肺間隔變薄，肺泡面積相應(yīng)增加，小氣道管腔黏液分泌及堵塞情況改善(圖1)。

表1 針刺對(duì)COPD模型大鼠的吸氣阻力、呼氣阻力及肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性的影響

A：正常對(duì)照組(肺泡結(jié)構(gòu)清晰、勻稱)；B：模型組(肺間隔增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；小氣道管腔多見分泌物)；C:電針7次組(肺間隔變薄、氣道分泌物減少)；D：電針14次組

2.2針刺對(duì)COPD大鼠BALF及血漿中IFN-γ、IL-4的影響 ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在模型組大鼠BALF及血漿中IFN-γ含量均非常顯著升高(P<0.001)；IL-4含量也有不同程度升高(P<0.05；P<0.01)?？梢?，IFN-γ比IL-4含量的升高更為顯著，表明Th1細(xì)胞在模型組中占有優(yōu)勢(shì)，Th1/Th2平衡傾向于Th1(表2)。與對(duì)照組IFN-γ/IL-4比較，模型組大鼠BALF中的比值顯著降低(P<0.01)，但血漿中比值增高(P<0.05)，表明在肺的局部環(huán)境中，Th2占優(yōu)勢(shì)，而在全身反應(yīng)中，依然是Th1占優(yōu)勢(shì)。見表3。

與模型組相比，在電針7次、14次組大鼠BALF及血漿中，IFN-γ和IL-4含量均有不同程度降低(P<0.05；P<0.001)，可見電針下調(diào)了模型大鼠IFN-γ、IL-4的含量；電針兩組相比，除14次組BALF中IFN-γ下調(diào)更多(P<0.01)，余均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。與模型組BALF中IFN-γ/IL-4比較，電針7次組的比值顯著升高(P<0.001)，而電針14次組卻無(wú)明顯變化(P>0.05)，且與電針7次組差異顯著(P<0.001)；電針后，血漿中的IFN-γ/IL-4均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。表明針刺對(duì)肺及全身的Th細(xì)胞均有調(diào)節(jié)作用，且電針7次即可發(fā)揮較大的調(diào)節(jié)效應(yīng)。

表2 針刺對(duì)COPD大鼠肺泡灌洗液及血漿中IFN-γ和IL-4的影響

表3 針刺對(duì)COPD大鼠肺泡灌洗液及血漿中IFN-γ/IL-4的影響

2.3IFN-γ和IL-4與肺功能的相關(guān)性分析 以BALF和血漿中的IFN-γ和IL-4與肺功能中關(guān)鍵指標(biāo)Re進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，血漿中IL-4與Re呈顯著正相關(guān)(r=0.937,P<0.01)，其他無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.293～0.479,P>0.05,n=7)，表明關(guān)鍵肺功能指標(biāo)的變化可能受IL-4的影響。

3 討 論

COPD患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂和低下〔1〕。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)部分患者在戒煙后，肺部的損害并未完全停止，仍有持續(xù)進(jìn)展，因此，也有學(xué)者提出，COPD 是自身免疫性疾病的假設(shè)〔7〕。Th1與Th2細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持機(jī)體正常的免疫功能起重要作用，Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)可促進(jìn)某些器官特異性自身免疫病的發(fā)展。Th細(xì)胞亞群平衡失調(diào)與COPD這一炎癥性疾病的發(fā)生具有重要關(guān)系〔8，9〕。

研究者多以檢測(cè)IFN-γ和IL-4(或IL-10)的含量及IFN-γ/IL-4，來(lái)反映Th1和Th2細(xì)胞亞群，并分析Th1/Th2免疫平衡〔10〕。在呼吸疾病中，一般認(rèn)為，哮喘氣道炎癥主要與Th2功能亢進(jìn)相關(guān)，COPD氣道炎癥主要與Th1細(xì)胞相關(guān)，但也有研究表明COPD與哮喘一樣均表現(xiàn)為Th2功能亢進(jìn)特征〔4〕。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型符合COPD在病理和肺功能上的特點(diǎn)，同時(shí)，Th1細(xì)胞占有優(yōu)勢(shì)，Th1/Th2平衡格局傾向于Th1。

COPD病程復(fù)雜，最近Tsoumakidou等〔11〕根據(jù)COPD臨床分期的不同，觀察到急性加重期Th細(xì)胞平衡可能表現(xiàn)出與穩(wěn)定期不同的特點(diǎn)，急性加重期Th1細(xì)胞平衡呈現(xiàn)出向Th2端漂移的特點(diǎn)。且COPD炎癥機(jī)制復(fù)雜，與經(jīng)典的Th1或Th2介導(dǎo)的自身免疫性疾病相比，缺乏典型的特征〔12〕。故在臨床上，經(jīng)典的免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑治療收效甚微。

針刺是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)療法，用于治療和預(yù)防疾病已有數(shù)千年的歷史。針刺治療呼吸系統(tǒng)疾病，一直受到針灸學(xué)者的重視。早在1961年薩藤山川等報(bào)道針刺可使哮喘患者呼吸道的阻力下降。1981年張笑平報(bào)道連續(xù)針刺肺俞穴1 w可使哮喘患者的肺通氣量明顯增加，且停針后其效應(yīng)仍可維持較長(zhǎng)時(shí)間。1997年張壓西等發(fā)現(xiàn)針刺肺俞穴能明顯改善肺通氣功能，在肺俞穴不同的留針時(shí)間對(duì)患者的肺通氣功能有不同的改善。德國(guó)〔13〕和日本學(xué)者〔14〕的研究均發(fā)現(xiàn)COPD患者用針刺進(jìn)行治療，治療14 d后肺通氣功能顯著得到改善，生活質(zhì)量也有較大程度的提高。針刺不僅可以改善肺及支氣管的通氣功能,調(diào)節(jié)大、中、小氣道阻力，而且對(duì)人體的免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用〔15〕。

Yamaguchi等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)針刺中醫(yī)經(jīng)穴能上調(diào)正常成年人CD2+、CD4+、CD8+等細(xì)胞及IL-4，IL-1β和IFN-γ的水平。本實(shí)驗(yàn)中選取肺俞和足三里穴進(jìn)行針刺，因?yàn)橹嗅t(yī)理論認(rèn)為，肺俞穴是足太陽(yáng)膀胱經(jīng)的重要穴位，是肺的“背俞穴”，肺俞穴為肺氣所輸注的部位，能疏泄肺氣，又是肺臟氣血在背部的反映點(diǎn),可以接受針灸刺激，并通過(guò)其經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)，對(duì)肺臟氣血起調(diào)節(jié)作用，損有余而補(bǔ)不足，使人體氣血陰陽(yáng)維持動(dòng)態(tài)平衡。針灸肺俞穴可明顯提高健康人的用力肺活量。該穴不僅是臨床治療和研究中應(yīng)用最廣泛的穴位，也是目前基礎(chǔ)研究針灸調(diào)節(jié)肺臟功能的常用穴位。足三里穴是足陽(yáng)明胃經(jīng)之合穴,“胃者五臟六腑之海也。水谷皆入于胃，五臟六腑之氣皆稟于胃”， 又脾胃互為表里，為后天之本，氣血生化之源，是機(jī)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。足三里穴為胃經(jīng)之要穴，具有理脾胃、調(diào)氣血、補(bǔ)虛弱、宣暢氣機(jī)等諸多功效而倍受關(guān)注。大量的研究證實(shí)，針灸足三里穴具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，且這種作用具有整體性和雙向性〔17〕，在呼吸系統(tǒng)疾病的研究中，發(fā)現(xiàn)針灸或穴位注射足三里穴均可使支氣管哮喘者過(guò)低的CD8+細(xì)胞升高，使增大的CD4+/ CD8+細(xì)胞比值縮小，過(guò)高的IL-4和IgE降低，控制哮喘的發(fā)病〔18〕。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫蠼?jīng)針刺后，肺通氣功能和肺病理得到一定程度的改善，且針刺能抑制Th1細(xì)胞，使Th1/Th2格局趨于平衡，且針刺7次即有調(diào)節(jié)作用。但針刺調(diào)節(jié)Th1/Th2似乎以肺為主，是否與肺的局部炎癥反應(yīng)有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

1鐘南山,姚婉貞,孫德俊.慢性阻塞性肺疾病熱點(diǎn)問題〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:254.

2Hodge G，Nairn J，Holmes M,etal.Increased intracellular T helper 1 proinflammatory cytokine production in peripheral blood，bronchoalveolar lavage and intraepithelial T cells of COPD subjects 〔J〕.Clin Exp Immunol,2007；150(1)：22-9.

3Barczyk A，Pierzcha W，Kon OM,etal.Cytokine production bybronchoalveolar lavage T lymphocytes in chronic obstructive pulmonary disease 〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2006；117(6):1484-92.

4劉 領(lǐng),趙淑敏,楊 霽,等.COPD患者Th1/Th2 平衡失調(diào)臨床觀察〔J〕.臨床肺科雜志,2011；16(9):1335-6.

5李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)〔M〕.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2003:288.

6宋小蓮,王昌惠,白 沖.脂多糖結(jié)合熏煙法和單純熏煙法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比較〔J〕.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010；31(3):246-8.

7Stefanska AM，Walsh PT.Chronic obstructive pulmonary disease：evidence for an autoimmune component 〔J〕.Cell Mole Immunol，2009；6(2):81-6.

8Pulendran B.Modulating Th1/Th2 responses with microbes，dendritic cells and pathogen recognition receptors〔J〕.Immunol Res,2004；29(1-3)：187-96.

9楊 捷,馮玉麟.樹突狀細(xì)胞與慢性阻塞性肺病〔J〕.國(guó)際內(nèi)科學(xué)雜志,2009；36(7):432-4.

10姚新生.Th1與Th2研究概況及進(jìn)展〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·免疫學(xué)分冊(cè),2002；25(6):290-3.

11Tsoumakidou M，Tzanakis N，Chrysofakis G,etal.Changes in sputum T-lymphocyte subpopulations at the onset of severe exacerbations of chronic obstructive pulmonry disease 〔J〕.Respir Med,2005；99(5):572-9.

12黃秋嬪,鐘小寧.T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在COPD肺氣腫發(fā)病機(jī)制中的作用〔J〕.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2010；30(2):190-4.

13Neumeister W，Kuhlemann H，Bauer T,etal.Effect of acupuncture on quality of life，mouth occlusion pressures and lung function in COPD〔J〕.Med Klin (Munich),1999；94(1):106-9.

14Suzuki M，Ohno Y，Namura K，etal.A case of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) successfully treated by acupuncture〔J〕.Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi,2005；43(5)：289-95.

15Maa SH，Sun MF，Hsu KH，etal.Effect of acupuncture or acupressure on quality of life of patients with chronic obstructive asthma：a pilot study〔J〕.J Altern Complement Med,2003；9(5)：659-70.

16Yamaguchi N，Takahashi T，Sakuma M,etal.Acupuncture regulates leukocyte subpopulations in human peripheral blood〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med，2007；4(4)：447-53.

17施 茵,吳煥淦.足三里穴在免疫功能調(diào)節(jié)中的應(yīng)用〔J〕.現(xiàn)代中醫(yī)藥,2003；3:3-5.

18胡志光，尹鋼林.針刺以支氣管哮喘患者T細(xì)胞亞群和IL-4的影響〔J〕.中國(guó)針灸，1999；19(2)：11.