熊國祚+++++劉輝++++李天平+++++顏亞平+++++申昕++++戴先鵬+++++鄧禮明++++畢國善++++++胡兵兵

[摘要] 目的 探討Caveolin-1對下肢缺血糖尿病大鼠缺血部位血管形成的作用及與AKT信號通路的關(guān)系。 方法 健康、雄性SD大鼠，在腹腔注射鏈脲菌素構(gòu)建的1型糖尿病大鼠模型上離斷左側(cè)股動脈及其分支，建立急性下肢缺血動物模型，14 d后用Western blot檢測Caveolin-1、AKT的表達(dá)水平；28 d后進(jìn)行CD34免疫組織化學(xué)染色和HE染色，評價血管密度。 結(jié)果 缺血組和糖尿病組與假手術(shù)組相比，Caveolin-1蛋白的表達(dá)水平明顯增加（P<0.05）；且缺血組Caveolin-1蛋白含量顯著高于糖尿病組（P<0.05）。缺血組、缺血轉(zhuǎn)染組、缺血空轉(zhuǎn)染組的Caveolin-1蛋白、AKT水平均明顯高于假手術(shù)組（P<0.05）；缺血轉(zhuǎn)染組與缺血組相比，Caveolin-1蛋白、AKT的表達(dá)水平明顯增多（P<0.05）。與假手術(shù)組相比，缺血組、缺血轉(zhuǎn)染組和缺血空轉(zhuǎn)染組的微血管均有一定程度增加，其中缺血轉(zhuǎn)染組的微血管密度增加尤為顯著（P<0.05）。 結(jié)論 Caveolin-1過表達(dá)后對糖尿病大鼠下肢缺血部位的血管形成有明顯的促進(jìn)作用，可能與激活A(yù)KT有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] Caveolin-1；糖尿病；下肢缺血

[中圖分類號] R587.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1674-4721（2014）06（c）-0004-05

The effects and mechanism of Caveolin-1 on limb ischemia region of diabetic rat

XIONG Guo-zuo1 LIU Hui2 LI Tian-ping3 YAN Ya-ping1 SHEN Xin1 DAI Xian-peng1 DENG Li-ming1 BI Guo-shan1 HU Bing-bing1

1.Department of Vascular Surgery,the Second Affiliated Hospital.University of South China,Hengyang 421001,China;2.Central Hospital of Yiyang City in Hunan Province,Yiyang 413000,China;3.The Institute ofPharmacy & Pharmacology,University of South China,Hengyang 421001,China

[Abstract] Objective To investigate the function of Caveolin-1 on angiogenesis in lower limb ischemia region of diabetic rat and the relationship with AKT signal pathway. Methods Intraperitoneal injection of healthy,male,SD rats with streptozocin to construct type 1 diabetic rat model,then broken the left femoral artery to set up the acute lower limb ischemia animal model.After 14 days with Western blot detection Caveolin-1 and AKT expression.CD34 immunohistochemical staining and HE staining was applied to detect the vascular density in 28 days. Results The level of Caveolin-1 in diabetes group and ischemia group was obviously higher than that in sham group respectively,the level of Caveolin-1 in ischemia group was higher than that in diabetes group,with statistical difference(P<0.05).The level of Caveolin-1 and AKT in ischemia group,ischemic transfection group,ischemic idling transfected group was obviously higher than that in sham group respectively,the level of Caveolin-1 and AKT in ischemic transfection group was obviously higher than that in ischemia group respectively,with statistical difference(P<0.05).Compared with the sham operation group,microvascular had a certain degree increased in ischemia group,ischemia transfection group and ischemic idling transfected group,the microvessel density in the ischemic transfection group increased significantly(P<0.05). Conclusion The higher expression of Caveolin-1 in diabetic lower limb ischemia in rats has obvious promoting effect to its angiogenesis,this effect may be related to activation of AKT.

[Key words] Caveolin-1;Diabetes;Lower limb ischemia

糖尿病已成為嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，發(fā)病率繼腫瘤、心腦血管病之后居第三位。下肢血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，如何重建動脈血流、恢復(fù)缺血區(qū)域血液供應(yīng)是治療糖尿病下肢血管病變的重點(diǎn)，也是臨床醫(yī)生關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。作為小凹蛋白家族中最重要的成員，Caveolin-1是一種半跨膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，其很可能在糖尿病下肢缺血性疾病中起重要作用[2-3]。Caveolin-1可以通過激活蛋白激酶信號通路來促進(jìn)血管新生，改善局部缺血情況[4-5]。本研究主要探討Caveolin-1對糖尿病下肢血管病變大鼠的缺血恢復(fù)情況的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物70只SD雄性大鼠，鼠齡10～12周，體重（300±20） g，由本校動物實(shí)驗(yàn)部提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器Bio-Rad的蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（PowerPacTMBasic，美國）；Eppendorf的高速離心機(jī)（5804型、5804R型，德國）；天能的全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon-6200，上海）；Olympus的顯微鏡與型顯微攝像系統(tǒng)（BX51，日本）；Sartorius的電子天平（BSA223S，美國）；海門其林貝爾的脫色搖床（ZD-9550，中國）；Sanyo的-80℃冰箱（日本）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑pCDNA3.1（+）Caveolin-1（南華大學(xué)藥物藥理研究所贈）；Mouse anti-β-actin （BM0627，武漢博士得，中國）；Rabbit polyclonal to Caveolin-1（081030，華安，中國）；Goat Anti Rabbit IgG（H+L）（sc-2004，Santa Cruz，美國）；兔抗大鼠CD34單克隆抗體（C2386-12A，USBIO，美國）；兔抗大鼠多克隆抗體AKT（9271L，CST，美國）；DAB顯色試劑盒（長沙艾杰，中國）；枸櫞酸（天津大茂，中國）；SP-9000 HistonstainTM-Plus Kits免疫組化試劑盒（北京中杉金橋，中國）；青霉素（山東魯抗，中國）；枸櫞酸三鈉（天津大茂，中國）；鏈脲菌素（STZ，Sigma，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 1型糖尿病大鼠模型的建立按照文獻(xiàn)[6]準(zhǔn)備枸櫞酸緩沖液，然后取健康雄性SD大鼠，禁食12 h后，以50 mg/kg STZ的劑量，腹腔注射（STZ用0.1 mol/L新鮮配制枸櫞酸緩沖液稀釋配置）。3 d后檢測所有大鼠的空腹血糖，采用鼠尾采血的方法，連續(xù)14 d空腹血糖濃度>16.8 mmol/L，作為1型糖尿病大鼠模型。

1.2.2 急性下肢缺血動物模型的建立實(shí)驗(yàn)分為兩部分：①正常大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血組、糖尿病組；②將1型糖尿病大鼠（前面實(shí)驗(yàn)所建立）隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血組、缺血Caveolin-1轉(zhuǎn)染組（簡稱缺血轉(zhuǎn)染組）、缺血空轉(zhuǎn)染組，每組10只，術(shù)前均禁食12 h，用10%水合氯醛（3 ml/kg）進(jìn)行麻醉，然后在大鼠的左側(cè)腹股溝韌帶致膝關(guān)節(jié)間作一縱行切口，分離股動脈，各組均于近心端結(jié)扎股動脈（假手術(shù)除外），并離斷下端及其分支，腹腔注射青霉素[200 000 U/（d·kg）]，持續(xù)3 d（圖1）。

圖1 股動脈離斷并結(jié)扎手術(shù)

A.切開皮膚與皮下組織；B.暴露股動脈；C.離斷股動脈分支并結(jié)扎；D.離斷股動脈并結(jié)扎

1.2.3 Caveolin-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法及鑒定取兩份相同體積無血清培養(yǎng)基，將提取好的質(zhì)粒和lipofectamineTM2000（Invitrogen，美國）分別稀釋于其中（質(zhì)量比為1∶3），在室溫中靜置4 min后將兩者混合均勻，并靜置20 min。當(dāng)轉(zhuǎn)染組血糖穩(wěn)定14 d后，通過尾靜脈注入配好的轉(zhuǎn)染試劑；空轉(zhuǎn)染組注射同等劑量不含Caveolin-1質(zhì)粒的脂質(zhì)體溶液。14 d后處死一半大鼠并收集腓腸肌肉組織用于Western blot檢測各組Caveolin-1的表達(dá)，觀察其轉(zhuǎn)染情況。

1.2.4 Western blot檢測腓腸肌肉組織中Caveolin-1和AKT的表達(dá)取-80℃凍存的腓腸肌肌肉組織，提取組織總蛋白，并用BCA法測蛋白濃度；然后將總蛋白樣品40 μg與10 μl上樣緩沖液混勻后，于100℃沸水中煮10 min使蛋白變性，于-20℃保存?zhèn)溆?。電泳分離：用10%聚丙烯凝膠分離蛋白，濃縮電壓為70 V，時間約為30 min，分離電壓為120 V，時間約為60 min；轉(zhuǎn)膜：350 mA，3 h；5%的脫脂奶粉中37℃封閉1 h；TBST液沖洗15 min×3次后；加入1∶500比例稀釋的一抗，4℃孵育過夜；TBST液沖洗15 min×3次后；加入1∶1000比例稀釋的二抗，37℃恒溫孵育45 min，再用TBST洗膜15 min×4次；顯影。

1.2.5 腓腸肌肌肉組織的病理檢測術(shù)后第28天處死各組余下的大鼠，取左側(cè)腓腸肌肌肉標(biāo)本，并剝離周圍的肌腱和脂肪組織，進(jìn)行HE染色和CD34蛋白免疫組化[7]實(shí)驗(yàn)。所得切片用顯微鏡攝像，得到不同倍數(shù)的照片（40、100、200）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組Western blot檢測Caveolin-1表達(dá)的比較

正常大鼠的缺血組和糖尿病組與假手術(shù)組相比，Caveolin-1蛋白的表達(dá)水平明顯增加（P<0.05）；且缺血組Caveolin-1蛋白含量顯著高于糖尿病組（P<0.05）（圖2）。

圖2 3組Western blot檢測Caveolin-1表達(dá)的比較（n=3）

與假手術(shù)組比較，*P<0.05

2.2 4組Western blot檢測Caveolin-1表達(dá)及AKT表達(dá)的比較

缺血組、缺血轉(zhuǎn)染組、缺血空轉(zhuǎn)染組的Caveolin-1蛋白水平均明顯高于假手術(shù)組（P<0.05）；缺血轉(zhuǎn)染組與缺血組相比，Caveolin-1蛋白的表達(dá)水平明顯增多（P<0.05）（圖3）。缺血組、缺血轉(zhuǎn)染組、缺血空轉(zhuǎn)染組的AKT表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組（P<0.05）；缺血轉(zhuǎn)染組的AKT表達(dá)較缺血組明顯增多（P<0.05）（圖4）。

圖3 4組Western blot檢測Caveolin-1表達(dá)的比較（n=4）

與假手術(shù)組比較，*P<0.05、**P<0.05；與缺血組比較，**P<0.05

圖4 4組Western blot檢測AKT表達(dá)的比較（n=4）

與假手術(shù)組比較，*P<0.05、**P<0.05；與缺血組比較，**P<0.05

2.3 腓腸肌肌肉組織HE染色觀察微血管/肌纖維束的比值（微血管數(shù)/肌纖維束數(shù)）

術(shù)后28 d取各組余下小鼠的左側(cè)腓腸肌肌肉組織進(jìn)行HE染色，觀察肌肉組織中微血管/肌纖維束比值（微血管數(shù)/肌纖維束數(shù)），與假手術(shù)組相比，缺血組、缺血轉(zhuǎn)染組和缺血空轉(zhuǎn)染組腓腸肌肌肉組織中的微血管/肌纖維束比值明顯增大（P<0.05）；缺血轉(zhuǎn)染組的微血管/肌纖維束比值顯著高于缺血組（P<0.05）；缺血組與缺血空轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖5、圖6）。

圖5 各組腓腸肌肌肉組織HE染色（100×）

A.假手術(shù)組；B.缺血組；C.缺血轉(zhuǎn)染組；D.缺血空轉(zhuǎn)染組

圖6 HE染色檢測各組肌肉組織中微血管/肌纖維束比值（n=4）

與假手術(shù)組比較，*P<0.05、**P<0.05；與缺血組比較，**P<0.05

2.4 CD34免疫組化染色檢測腓腸肌肌肉組織中微血管密度（MVD）

S-P染色法檢測各組腓腸肌肌肉組織中CD34的表達(dá)情況，缺血組、缺血轉(zhuǎn)染組和缺血空轉(zhuǎn)染組棕褐色顆粒增加，CD34的表達(dá)增多，與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；缺血轉(zhuǎn)染組比缺血組增加明顯（P<0.05）；缺血組與缺血空轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖7、圖8）。

圖7 CD34免疫組織化學(xué)染色觀察腓腸肌肉組織內(nèi)微血管情況（200×）

A.假手術(shù)組；B.缺血組；C.缺血轉(zhuǎn)染組；D.缺血空轉(zhuǎn)染組

3 討論

目前世界各國糖尿病的患病率均呈急劇上升趨勢，據(jù)報道，到2025年為止全世界糖尿病患者有望超過3億[8]，由糖尿病周圍血管病變引發(fā)的糖尿病足潰瘍與壞疽，是糖尿病患者致死、致殘的重要原因之一[9-10]，因此尋找新的治療方法，提高患者生活質(zhì)量和存活率已經(jīng)迫在眉睫。Caveolin-1是形成小凹的主要蛋白成分，高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，其在血管新生中的作用越來越受到人們的重視，但是Caveolin-1在血管形成中的具體功能仍存在較大爭議，有文獻(xiàn)報道，高糖引起糖尿病血管病變可能與其誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞上Caveolin-1的表達(dá)有關(guān)，在沒有合并糖尿病的缺血組織中Caveolin-1具有明顯的促血管生成作用[11-13]，可見Caveolin-1在糖尿病患者血管病變過程中的具體作用存在很大爭議，還有待進(jìn)一步考究，推測在高血糖狀況下只有Caveolin-1的表達(dá)水平達(dá)到一定程度才能促進(jìn)缺血組織中的血管形成。

本實(shí)驗(yàn)通過建立糖尿病大鼠下肢急性缺血大鼠模型，在術(shù)后用Western blot檢測各組腓腸肌肌肉組織中Caveolin-1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，缺血組和糖尿病組Caveolin-1蛋白的表達(dá)水平顯著增加，但糖尿病組Caveolin-1蛋白的表達(dá)水平升高沒有缺血組明顯，提示正常大鼠下肢缺血時腓腸肌肌肉組織能夠通過上調(diào)Caveolin-1蛋白的表達(dá)水平來緩解缺血，但是糖尿病大鼠一旦出現(xiàn)同樣的癥狀，其通過上調(diào)Caveolin-1來自我恢復(fù)的能力則明顯下降，具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步討論。本研究還通過在正常大鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)染Caveolin-1來觀察其缺血部位的血管形成，HE染色和CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果證實(shí)，高表達(dá)的Caveolin-1可促進(jìn)缺血部位的血管形成。

AKT又稱蛋白激酶B，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，也是磷脂酰肌醇激酶（PI3K）的下游靶蛋白之一，可參與調(diào)節(jié)多種生命活動，與其直接磷酸化多種細(xì)胞因子密切相關(guān)[13]。眾多研究證實(shí)，通過上調(diào)PI3K/AKT通路可使多種重要生長因子發(fā)揮促血管生成的生物學(xué)功能[6，14-18]。有文獻(xiàn)報道，在表皮成纖維細(xì)胞中Caveolin-1能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄生長因子β誘導(dǎo)的PI3K-AKT信號通路，轉(zhuǎn)染Caveolin-1腺病毒可以促進(jìn)AKT磷酸化[4]。AKT活化后又可以激活下游的一氧化氮合酶（eNOS）等[19]。Matthews等[20]發(fā)現(xiàn)在IGF-1的誘導(dǎo)下，來源于Caveolin-1缺陷小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)AKT的磷酸化水平明顯低于未缺陷小鼠，因此Caveolin-1可以通過調(diào)節(jié)AKT/NO的生成而介導(dǎo)血管形成，改善缺血部位的血液供應(yīng)，那么高濃度的Caveolin-1在糖尿病下肢缺血肌肉組織的促血管生成作用是否也與激活A(yù)KT信號通路有關(guān)？本研究圖3、圖4所示，AKT的表達(dá)水平與Caveolin-1蛋白水平呈正比，可見Caveolin-1在糖尿病下肢缺血動物模型中對血管生成的促進(jìn)作用可能與其激活A(yù)KT信號通路有關(guān)。

綜上所述，Caveolin-1在糖尿病大鼠下肢缺血部位過表達(dá)時具有促進(jìn)血管生成的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)AKT蛋白表達(dá)有關(guān)，這為研究和治療糖尿病下肢血管病變提供了新的思路和方法。

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（收稿日期：2014-03-12本文編輯：李亞聰）

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（收稿日期：2014-03-12本文編輯：李亞聰）