榮良燕姚拓， 馮 今，杜笑村，李儒仁，陳 龍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省草原技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730046；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

我國農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中，氮、磷素供應(yīng)量直接影響作物潛在生產(chǎn)性能和生態(tài)功能的發(fā)揮，而化肥一直被認(rèn)為是解決這一問題的主要途徑。在經(jīng)濟(jì)落后且土地貧瘠的西部地區(qū)，大量使用高成本的化肥是增加農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)成本的主要因素之一[1]。隨著化肥施用量的增加，出現(xiàn)了肥效下降、利用率降低等現(xiàn)象，此外，生產(chǎn)化肥對非再生能源消耗大，破壞土壤結(jié)構(gòu)及微生物多樣性等，加劇土壤退化。因此，探尋新的低能耗、低排放及環(huán)境友好型肥料以部分替代化肥，實(shí)現(xiàn)高效益的循環(huán)農(nóng)業(yè)已顯得很重要。

研究表明，PGPR微生物肥具有良好的固氮、溶磷、分泌植物激素及抑制植物致病菌的能力，同時(shí)具有生長快、競爭力強(qiáng)、利用碳源譜廣等特點(diǎn)[2-4]。接種PGPR復(fù)合制劑，與常規(guī)施肥相比，大豆早熟2～3 d，根瘤數(shù)增加3.0～26.8個(gè)/株，百粒質(zhì)量增加0.2～0.8 g，產(chǎn)量提高3.2%～12.7%[5]；施用PGPR接種劑替代20%～30%化肥，玉米株高、地上植物量、穗長、單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量等均有提高[6]；增施促生菌肥與常規(guī)施肥相比，地下塊莖部分鉀素吸收率高出9.98%，氮素吸收率高出19.61%，磷素吸收率高出20.1%，馬鈴薯產(chǎn)量比常規(guī)施肥提高12.4%[7]。試驗(yàn)利用分離自小麥、苜蓿、三葉草、豌豆等植物根際的優(yōu)良PGPR菌株制成微生物肥，替代20%～30%的化肥，研究其對豌豆生長的影響，以期為定向利用微生物資源提供理論支撐，為發(fā)展循環(huán)農(nóng)業(yè)，節(jié)約購買性資源投入量提供新途徑。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地設(shè)在甘肅省武威市涼州區(qū)，海拔2 100～4 800 m，地處N 37°23′～38°12′，E 101°59′～103°23′，年均溫7.8 ℃，極端氣溫最高36.6 ℃，最低-29.8 ℃。年均降水量60～160 mm，蒸發(fā)量1 400～3 010 mm，年日照時(shí)數(shù)2 200 h，無霜期85～165 d，pH7.2～7.5。

1.2 供試材料與設(shè)計(jì)

1.2.1 供試材料 試驗(yàn)豌豆(Pisumsativum)品種MZ-1，發(fā)芽率85%。菌肥甲由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草地微生物試驗(yàn)室提供菌種自制；菌肥乙為成品微生物肥料冀生物磷鉀肥?；誓蛩?含N 46%)，磷二銨(含P 46%，N 18%)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 微生物肥甲的篩選：從PGPR供試菌株Lx191、Jm92、Jm170、LM4-3、LS1-1、LS1-2、LS3、LS13、LHS4-1、LHS4-2、LHS8、LHS9、LHS11、LHS14、LH11和LH12-3(由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草地微生物試驗(yàn)室提供)，選出具有農(nóng)牧業(yè)應(yīng)用潛力的優(yōu)良促生菌株混合。

篩選方法：(1)菌株溶磷能力測定采用溶磷圈法和鉬藍(lán)比色法[8-10]；(2)菌株固氮酶活性測定利用氣相色譜儀(GC)，采用乙炔還原法測定菌株固氮酶活性[9-11]；(3)菌株分泌生長激素(IAA)測定用比色法[12]。

根瘤菌擴(kuò)大培養(yǎng)：將保存在4 ℃培養(yǎng)基(YMA)斜面上的豌豆根瘤菌株GDB27(由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供)，置于28 ℃環(huán)境下1～2 h，畫線接種于YMA固體平板培養(yǎng)基上，3～4個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)24～48 h。待菌株充分生長后，挑取典型的單菌落劃線接種到Y(jié)MA固體斜面培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)箱。48 h后，取3～5 mL無菌水于試管中，制成菌懸液。500 mL三角瓶中裝入200 mL滅菌的YMA液體培養(yǎng)基，在無菌環(huán)境下將菌懸液2～3 mL置于三角瓶中，150 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)5～7 d。菌株充分生長后，測定發(fā)酵菌液的OD660 nm值。當(dāng)OD660 nm值>0.5時(shí)，發(fā)酵菌液中的細(xì)胞數(shù)目>109個(gè)/mL。無菌條件下，將發(fā)酵菌液注入滅菌后的玻璃瓶中密封常溫保存。YMA培養(yǎng)基成分為NaCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，甘露醇10.0 g酵母膏0.5 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8。制作方法參照文獻(xiàn)[13-15]。

PGPR菌肥制作：將3～5 mL滅菌水置于接種好的混合供試PGPR菌株的斜面上，制成菌懸液。在500 mL三角瓶內(nèi)裝入200 mL LB液體培養(yǎng)基，滅菌后置于室溫下2～3 d，經(jīng)檢驗(yàn)無污染后，分別將各菌株的菌懸液1 mL裝入LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，28 ℃，125 r/min搖床上培養(yǎng)2～3 d。待菌株充分生長后，測定發(fā)酵菌液OD660 nm值。當(dāng)OD660 nm值>0.5時(shí)，發(fā)酵菌液中的細(xì)胞數(shù)目為109個(gè)/mL，無菌條件下，將發(fā)酵菌液注入滅菌玻璃瓶中密封常溫保存。LB培養(yǎng)基成分為：酵母膏 5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5～10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。制作方法參照文獻(xiàn)[13-15]。

將根瘤菌菌肥和PGPR菌肥發(fā)酵菌液以1∶1的比例混合制成微生物肥甲。

田間試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理和對照(CK)，處理A菌肥甲+70%化肥；處理B 菌肥乙+70%化肥；處理C 菌肥甲+80%化肥； CK 全量化肥(100%化肥)，各處理重復(fù)3次，共12個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積2.8 m×8.0 m，間距20 cm。CK全量化肥磷二胺為300 kg/hm2，尿素120 kg/hm2(純N 105 kg/hm2，純P 135 kg/hm2)。

拌種：每1 000 mL菌肥拌種20 kg(CK不拌種)，置陰涼處2 h后可播種。播種量225 kg/hm2，點(diǎn)播，行距0.25 m，株距0.10～0.15 m。

1.3 測定指標(biāo)及方法

株高：分別在豌豆的初花期(5月20日)、盛花期(6月16日)和成熟期(7月4日)測量各處理的植株絕對株高，每小區(qū)隨機(jī)取10～15個(gè)樣，計(jì)算平均值。

地上生物量：在初花期、盛花期和成熟期，每小區(qū)隨機(jī)取樣10株測量地上部分鮮重，待取樣的植株完全風(fēng)干至恒重后稱量干重，計(jì)算平均值。

地下生物量：在初花期、盛花期和成熟期，隨機(jī)選取10株，清洗干凈，測量其根長、用掃描儀測量根體積和根表面積，最后風(fēng)干根樣至恒重稱量干重，計(jì)算出平均值。

考種及籽粒產(chǎn)量：成熟期豌豆樣品完全風(fēng)干后對單株結(jié)莢數(shù)、單莢粒數(shù)及單株粒重進(jìn)行記錄。將豌豆籽粒剝離后測量千粒質(zhì)量及籽粒產(chǎn)量(經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量)，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量測量方法：各小區(qū)除去邊行0.5 m后單打單收，以打碾產(chǎn)量折算公頃產(chǎn)量，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)及其促生特性

對供試的Lx191、Jm92、Jm170、LM4-3、LS1-1、LS1-2、LS3、LS13、LHS4-1、LHS4-2、LHS8、LHS9、LHS11、LHS14、LH11和LH12-3菌株進(jìn)行溶磷能力、固氮酶活性、分泌IAA能力測定，綜合菌株培養(yǎng)特性、生長速度和溶磷量、固氮酶活性及分泌IAA等促生特性篩選出具有農(nóng)牧業(yè)應(yīng)用潛力的優(yōu)良促生菌株5株，其在LB培養(yǎng)基上的主要培養(yǎng)特性和促生特性見表1。

2.2 PGPR微生物肥對豌豆生長影響

2.2.1 對豌豆株高的影響 初花期，盛花期和成熟期的豌豆植株絕對株高顯著性分析顯示，各施肥處理下應(yīng)試植株株高和CK相比差異不顯著(表2)。處理A、B、C在初花期分別高于CK 3.7%，-0.8%，6.3%；盛花期各處理均高于CK，最高為2.1%；成熟期除處理B外均高于CK，處理C達(dá)6.1%。綜合株高平均增長率從大到??；處理C(4.8%)>處理A(1.6%)>處理B(-1.4%)。表明在減少20%～30%化肥量，代之以菌肥甲后對豌豆植株高度有一定程度提高。

表1 優(yōu)良菌株的培養(yǎng)特性和促生特性

表2 微生物肥下單作豌豆各物候期的株高、根長、根系干重

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2.2 對豌豆地上生物量的影響 豌豆的3個(gè)時(shí)期干、鮮重顯著性分析表明，各處理間均無顯著差異(圖1)。初花期處理C鮮、干重為最佳，分別為2 670.97、

1 337.31 kg/hm2，較CK分別增加15.5%、17.5%；處理B鮮、干重與CK基本持平。處理A干重略低于CK，鮮重較CK提高249.47 kg/hm2，說明處理A對提高植物鮮重有一定效果。盛花期植株鮮重處理A、C較CK分別提高8.3%、11.1%，處理B略低于CK。盛花期干物質(zhì)產(chǎn)量雖無顯著性差異，但處理C最高，較CK提高6.0%，處理A、B均較CK有所降低。豌豆成熟期處理C的鮮、干重與CK基本持平，處理A、B較CK有所減少。由此可見成熟期豌豆所需營養(yǎng)較高，化肥施用量不能少于70%，否則會影響地上物質(zhì)產(chǎn)量；此外，處理C的結(jié)果說明，微生物肥甲不僅可代替20%化肥，而且不會減產(chǎn)。

圖1 微生物肥下單作豌豆各物候期的地上植物量

2.2.3 對豌豆根長的影響 對初花期，盛花期和成熟期豌豆根長進(jìn)行顯著性分析顯示，各生育期3個(gè)處理與CK相比均無顯著性差異(表2)。處理C根長在各個(gè)生育期均為最高，處理A與處理C接近，兩者均比CK有所增加，處理B在盛花期較CK降低4.4%。說明減少20%～30%化肥，代之以菌肥甲可增加豌豆的根長。

2.2.4 對豌豆根系干重的影響 對初花期，盛花期和成熟期豌豆根系干重進(jìn)行顯著性分析顯示，各生育期3個(gè)處理與CK相比均無顯著差異(表2)。減少20%～30%化肥代之以微生物肥對初花期根系干重的影響結(jié)果處理C >處理B >處理A>CK，其中，處理C較CK提高8.0%；盛花期處理C >處理A >處理B >CK，處理C可使地下根系干重提高26.4%；成熟期除處理C外，其余2個(gè)處理較CK有所下降，說明減少化肥20%、增施微生物肥甲在一定程度上可提高豌豆地下根系干重。

2.2.5 對豌豆根表面積及根系體積的影響 對初花期，盛花期和成熟期豌豆根表面積進(jìn)行顯著性測驗(yàn)分析顯示，各生育期3個(gè)處理與CK相比均無顯著性差異(圖2 a)。初花期、盛花期和成熟期處理C與CK相比，分別提高3.4%，22.7%和8.6%；處理A在3個(gè)時(shí)期與CK相比略有減少；處理B與CK持平。同時(shí)，接種微生物肥后豌豆各生育期根系體積與CK相比也無顯著性差異(圖2 b)，其中，處理C最好，較CK在3個(gè)時(shí)期分別提高5.5%，42.6%和12.1%，微生物肥對豌豆根系表面積和體積的影響在盛花期要明顯優(yōu)于其他2個(gè)時(shí)期。

圖2 微生物肥下間作豌豆各物候期的單株根系表面積和根系體積

2.2.6 對豌豆產(chǎn)量構(gòu)成因素及籽粒產(chǎn)量的影響 對不同處理?xiàng)l件下的單株結(jié)莢數(shù)、單莢粒數(shù)、單株粒重、千粒質(zhì)量進(jìn)行顯著性分析，各處理與CK之間均無顯著性差異(表3)。處理C在產(chǎn)量構(gòu)成因素的各個(gè)指標(biāo)中均高于CK，且優(yōu)于其他2個(gè)處理。處理A在單莢粒數(shù)和千粒重2個(gè)指標(biāo)上高于CK，其他指標(biāo)較CK略低。處理B的單株粒重低于CK，其他指標(biāo)均和CK持平或略高。說明施用微生物接種劑(菌肥甲)可替代至少20%化肥并且未降低各產(chǎn)量構(gòu)成因素。豌豆經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量各處理與CK之間均無顯著性差異，處理C的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量較CK提高3.2%，處理A、B略低于CK，說明減少20%化肥量，施用微生物肥甲可提高豌豆的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，但減少30%化肥、施用微生物肥甲時(shí)，會對經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量有影響。相比之下，微生物肥乙的效果不及微生物肥甲。

表3 微生物肥下單作豌豆的產(chǎn)量構(gòu)成因素及籽粒產(chǎn)量

2.2.7 使用PGPR經(jīng)濟(jì)效益分析 對PGPR微生物肥使用后產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益進(jìn)行分析(表4)，結(jié)果表明，單作豌豆減少20%化肥可節(jié)省成本276.00元，減少30%化肥量可節(jié)省成本414.00元。在減少化學(xué)肥料的同時(shí)用PGPR微生物肥代替，按1 000 mL拌種20 kg豌豆種子，每1 000 mL菌肥5.00元計(jì)算，豌豆菌肥56.25元/hm2，購買微生物肥與節(jié)省化肥的使用量相比，成本降低220.00～358.00元/hm2。

表4 PGPR微生物肥經(jīng)濟(jì)效益分析

3 討論與結(jié)論

(1)篩選出Lx191、Jm92、LM4-3、LHS11和LH12-3這5個(gè)PGPR菌株，具備較強(qiáng)的溶磷、固氮、分泌生長激素和拮抗植物病原菌能力。將其與1株根瘤菌混合制成PGPR微生物肥，應(yīng)用于豌豆，各菌株間沒有明顯的抑制作用。

(2)2種微生物肥代替部分正?；实氖褂煤?，作物的生長趨勢為處理C>處理A>處理B>CK，采用微生物肥甲替代正?；适褂昧康?0%時(shí)，豌豆各項(xiàng)指標(biāo)顯示良好，并有一定程度的提高，當(dāng)微生物肥的使用量達(dá)到30%時(shí)產(chǎn)量略有下降，自制微生物接種劑(菌肥甲)的使用效果優(yōu)于引進(jìn)的微生物接種劑(菌肥乙)，以微生物接種劑(菌肥甲)替代20%化肥用量可使豌豆株高增加6.3%，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量提高3.2%。

(3)在不降低豌豆產(chǎn)量的前提下，使用PGPR微生物肥，可減少化肥投入量20%～30%，降低購買性資源220.00～358.00元/hm2。

(4)PGPR微生物肥使化肥減量，豌豆不減產(chǎn)的主要原因有土壤微生物的活動(dòng)促進(jìn)了土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，對土壤肥力的形成、植物營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化起著極其重要的作用；微生物肥中微生物的代謝有助于植物根系對水分、養(yǎng)分的吸收能力；微生物代謝活動(dòng)中分泌的激素可以刺激植物生長、拮抗植物病害，對植物的生長和發(fā)育具有促進(jìn)作用； 微生物在土壤中的定植和生長，可調(diào)節(jié)根際土壤的酸堿度，對于緩解西北部的堿性土壤起到重要作用[16-19]。

(5)各施用微生物菌肥處理與CK之間及各處理間差異均不顯著，即各處理的生長特性及產(chǎn)量較對照并無大幅度改變和提高，其原因是，微生物菌肥在施用一年后對植物的效果并無明顯改變，但應(yīng)關(guān)注長期使用微生物肥料的增產(chǎn)效果和生態(tài)學(xué)效應(yīng)，以降低長期使用化肥對土壤造成的退化、理化結(jié)構(gòu)改變及化肥在農(nóng)產(chǎn)品中殘留及污染為目的出發(fā)，改善農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、提高食品安全性，減少大量化肥使用對環(huán)境和土壤造成的污染，為農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)生態(tài)環(huán)境提供理論依據(jù)。

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