劉 媛 蔣菁蕊 吳少亙 曹望森 于成功 崔恒宓,3&

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008) 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院江蘇省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室2揚(yáng)州大學(xué)表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所3

微RNA(microRNAs, miRNAs)是一類長度一般為17～25個核苷酸的單鏈非編碼小RNA分子，可與相應(yīng)靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制，從而對基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[1]。研究證實miRNAs在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)表達(dá)模式改變，在腫瘤形成過程中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，起癌基因或抑癌基因樣作用[2]。因此，miRNAs表達(dá)譜有可能成為有效的腫瘤診斷分子標(biāo)記物。近年研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2, IGF2)基因的第7號內(nèi)含子中存在miR-483，但其功能迄今仍未能確定。IGF2基因已被證實在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤患者中呈高表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)；IGF2印記丟失(loss of imprinting, LOI)與結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險有密切聯(lián)系[3-5]。本研究以real-time PCR檢測miR-483-3p、miR-483-5p在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況并分析其診斷性能，為結(jié)直腸癌診斷和治療靶點的探索提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

收集2012年11月～2013年5月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院75例住院結(jié)直腸癌患者的癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織(距癌灶邊緣>5 cm)樣本。75例患者中男40例，女35例，年齡34～87歲，平均(65.1±12.9)歲。入組患者均未接受過放療或化療，經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診，臨床病理資料(性別、年齡、腫瘤大小、部位、分化程度、TNM分期等)完整，TNM分期根據(jù)2009年UICC/AJCC結(jié)直腸癌TNM分期(第七版)標(biāo)準(zhǔn)。組織標(biāo)本獲取后立即液氮速凍，-80 ℃冰箱長期保存。所有標(biāo)本采集均取得患者知情同意。

二、主要試劑和儀器

RNAlater?-ICE冰凍組織儲存液、TRIzol?試劑、Applied Biosystems?TaqMan?MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ、TaqMan?MicroRNA Assay、Applied Biosystems?7300 Real-Time PCR System(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.)。

三、方法

1. 組織總RNA提?。喝?0～100 mg組織，加入10倍體積的RNAlater?-ICE，充分混合后-20 ℃冰箱過夜(至少16 h)，使組織充分浸入。參照TRIzol?試劑說明書提取組織總RNA，紫外分光光度法測定RNA濃度和A260/A280比值，-80 ℃冰箱保存。

2. Real-time PCR：以500 ng RNA為模板行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系7.5 μL，包括10×RT緩沖液0.75 μL、RNA酶抑制劑0.095 μL、dNTPs(含 dTTP)0.075 μL、MultiScribeTMMuLV 0.5 μL和miRNA引物1.5 μL，余以ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)參數(shù)：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系10 μL，包括DEPC處理的ddH2O 2 μL、TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ(2×) 5 μL、TaqMan?MicroRNA Assay(20×) 0.5 μL和1∶3稀釋的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL。反應(yīng)參數(shù)：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。每一例樣本設(shè)置3個復(fù)孔。以2-△△CT法計算目的miRNAs相對表達(dá)量。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism 5軟件作圖。正態(tài)性檢驗顯示結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的miR-483-3p、miR-483-5p相對表達(dá)量不服從正態(tài)分布，以M(Q1,Q3)表示，兩組間比較采用配對樣本W(wǎng)ilcoxon符號秩和檢驗，癌組織中兩者間相關(guān)性的分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)，兩者表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征關(guān)系的分析采用Kruskal-Wallis檢驗。以受試者操作特征(ROC)曲線分析miR-483-3p、miR-483-5p對結(jié)直腸癌的診斷性能，選取最佳截點判斷診斷敏感性和特異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)直腸癌組織和癌旁組織miR-483-3p、miR-483-5p表達(dá)

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中的miR-483-3p、miR-483-5p相對表達(dá)量均明顯高于相應(yīng)癌旁非癌組織，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)(見圖1、圖2)。

二、結(jié)直腸癌組織中miR-483-3p與miR-483-5p表達(dá)的相關(guān)性

圖1 miR-483-3p在結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織中的表達(dá)

圖2 miR-483-5p在結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織中的表達(dá)

Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，結(jié)直腸癌組織中的miR-483-3p與miR-483-5p表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(rs=0.554 5,P<0.000 1)(見圖3)。

圖3 結(jié)直腸癌組織中miR-483-3p與miR-483-5p表達(dá)的相關(guān)性

三、miR-483-3p、miR-483-5p診斷性能分析

ROC曲線分析顯示，miR-483-3p診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.752 0(95% CI: 0.674 4～0.829 6)，最佳截點為9.22，其診斷敏感性和特異性分別為78.67%和62.67%(見圖4)；miR-483-5p診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.713 4(95% CI: 0.631 9～0.795 0)，最佳截點為11.61，其診斷敏感性和特異性分別為50.67%和85.33%(見圖5)。如兩者聯(lián)合檢測(并聯(lián)試驗)，診斷敏感性可提高至89.48%，特異性為53.48%。

圖4 miR-483-3p診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

圖5 miR-483-5p診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

四、結(jié)直腸癌組織中miR-483-3p、miR-483-5p表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌組織中miR-483-3p、miR-483-5p表達(dá)與腫瘤臨床病理特征之間關(guān)系的分析見表1，兩者表達(dá)與患者的性別、年齡以及腫瘤大小、部位、分化程度和TNM分期均無相關(guān)性(P>0.05)。

討 論

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，病死例數(shù)在全球男、女性腫瘤死因中分居第四和第三位[6]，而早期診斷和早期治療可明顯改善患者的預(yù)后。目前結(jié)直腸癌的早期篩查或檢查手段主要有糞隱血試驗(FOBT)、糞便DNA檢測、結(jié)腸鏡檢查、鋇灌腸檢查、CT結(jié)腸三維成像等，這些方法雖能檢出一些早期結(jié)直腸癌，但存在敏感性低、患者順應(yīng)性差或檢查費用高等不足之處[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)IGF2基因在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，而LOI是該現(xiàn)象較為公認(rèn)的發(fā)生機(jī)制，在腫瘤發(fā)生中起重要作用。研究證實結(jié)直腸癌患者癌組織、正常結(jié)腸黏膜和外周血細(xì)胞中均存在IGF2 LOI， 引起等位基因雙表達(dá)，導(dǎo)致IGF2基因表達(dá)水平成倍增高； IGF2 LOI與結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險有密切聯(lián)系[5]。

表1 結(jié)直腸癌組織中miR-483-3p、miR-483-5p表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

隨著對IGF2基因研究的不斷深入，現(xiàn)已逐步揭示出其在多種惡性腫瘤以及一些生理過程中與多種miRNAs之間存在密切聯(lián)系[8-12]，報道最多的即為miR-483。miR-483位于IGF2基因第7號內(nèi)含子中，與宿主基因IGF2共表達(dá)，兩者間存在相關(guān)性，但其具體功能尚未明確[11-12]。前期實驗發(fā)現(xiàn)與mRNA相比，miRNA的檢測具有敏感性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，作為生物學(xué)標(biāo)記物較mRNA更為可靠。因此，本研究擬通過檢測miR-483在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，探討其作為結(jié)直腸癌分子標(biāo)記物的可能性。

miRNAs前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被類似DICER的核酸內(nèi)切酶剪切為成熟的3p和5p片段[13]，近年研究顯示miRNAs的3p和5p片段在腫瘤細(xì)胞中具有不同甚至相反的作用[14-16]，如2012年Almeida等[16]報道m(xù)iR-28-3p和miR-28-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中有著不同的靶mRNA，對腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為具有不同影響。因此，本研究以real-time PCR分別檢測了結(jié)直腸癌組織和癌旁非癌組織樣本中的miR-483-3p和miR-483-5p表達(dá)，結(jié)果顯示兩者在結(jié)直腸癌組織中的相對表達(dá)量均顯著高于相應(yīng)癌旁非癌組織，且兩者表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。ROC曲線分析顯示，以9.22為診斷截點，miR-483-3p對結(jié)直腸癌有較高的診斷敏感性(78.67%)，而miR-483-5p診斷特異性相對較高(85.33%，診斷截點11.61)，兩者聯(lián)合檢測(并聯(lián)試驗)可將診斷敏感性提高至89.48%。然而，本研究未發(fā)現(xiàn)miR-483-3p、miR-483-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與包括性別、年齡、腫瘤大小、部位、分化程度和TNM分期在內(nèi)的腫瘤臨床病理特征之間存在相關(guān)性。上述發(fā)現(xiàn)表明miR-483-3p、miR-483-5p可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，有望成為結(jié)直腸癌診斷潛在的分子標(biāo)記物，但并不能提示腫瘤進(jìn)展及其臨床分期，可能需要進(jìn)一步探索其他特異性指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合診斷。后續(xù)擬進(jìn)一步通過體內(nèi)外實驗對miR-483-3p、miR-483-5p與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期變化及其遷移、侵襲能力等的相關(guān)性進(jìn)行研究，并對術(shù)后患者進(jìn)行長期隨訪，以全面評估兩者在結(jié)直腸癌中的臨床應(yīng)用價值，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的手段和思路。

1 Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116 (2): 281-297.

2 Zhang B, Pan X, Cobb GP, et al. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J]. Dev Biol, 2007, 302 (1): 1-12.

3 Chen YW, Boyartchuk V, Lewis BC. Differential roles of insulin-like growth factor receptor- and insulin receptor-mediated signaling in the phenotypes of hepatocellular carcinoma cells[J]. Neoplasia, 2009, 11 (9): 835-845.

4 Zhao R, Berho M, Nogueras J, et al. Positive correlation of insulin-like growth factor-Ⅱ with proliferating cell index in patients with colorectal neoplasia[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005, 14 (7): 1819-1822.

5 Cui H. Loss of imprinting of IGF2 as an epigenetic marker for the risk of human cancer[J]. Dis Markers, 2007, 23 (1-2): 105-112.

6 Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61 (2): 69-90.

7 Miller S, Steele S. Novel molecular screening approaches in colorectal cancer[J]. J Surg Oncol, 2012, 105 (5): 459-467.

8 Ohdaira H, Sekiguchi M, Miyata K, et al. MicroRNA-494 suppresses cell proliferation and induces senescence in A549 lung cancer cells[J]. Cell Prolif, 2012, 45 (1): 32-38.

9 Gebeshuber CA, Martinez J. miR-100 suppresses IGF2 and inhibits breast tumorigenesis by interfering with proliferation and survival signaling[J]. Oncogene, 2013, 32 (27): 3306-3310.

10 Ge Y, Sun Y, Chen J. IGF-Ⅱ is regulated by microRNA-125b in skeletal myogenesis[J]. J Cell Biol, 2011, 192 (1): 69-81.

11 Ma N, Li F, Li D, et al. Igf2-derived intronic miR-483 promotes mouse hepatocellular carcinoma cell proliferation[J]. Mol Cell Biochem, 2012, 361 (1-2): 337-343.

12 Ma N, Wang X, Qiao Y, et al. Coexpression of an intronic microRNA and its host gene reveals a potential role for miR-483-5p as an IGF2 partner[J]. Mol Cell Endocrinol, 2011, 333 (1): 96-101.

13 Griffiths-Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, et al. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature[D]. Nucleic Acids Res, 2006, 34 (Database issue): D140-D144.

14 Jiang L, Huang Q, Zhang S, et al. Hsa-miR-125a-3p and hsa-miR-125a-5p are downregulated in non-small cell lung cancer and have inverse effects on invasion and migration of lung cancer cells[J]. BMC Cancer, 2010, 10: 318.

15 López JA, Alvarez-Salas LM. Differential effects of miR-34c-3p and miR-34c-5p on SiHa cells proliferation, apoptosis, migration and invasion[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 409 (3): 513-519.

16 Almeida MI, Nicoloso MS, Zeng L, et al. Strand-specific miR-28-5p and miR-28-3p have distinct effects in colorectal cancer cells[J]. Gastroenterology, 2012, 142 (4): 886-896.e9.